1. 絕大部分干細(xì)胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可,。吸去胰酶后，殘留的那些無法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞,，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大,。簡單的程序是PBS潤洗吸去,，胰酶潤洗吸去，然后37℃消化,。比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化）,，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育。

2.細(xì)胞如何算是消化好了呢,？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了,，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層,，只要能移動了，多半呈沙壯移動,，其實(shí)已經(jīng)可以了,，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成*分離細(xì)胞，這是沒有必要的,。一般能移動了,，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了,，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）,。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好,，間隙很大,，才停止。細(xì)胞就是*成單個干細(xì)胞懸液,，之后在貼壁的過程中仍然會聚集,，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性,。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致,，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確,，仍然成片分布,，甚至*吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布,，這是細(xì)胞的特性,，是因?yàn)橘N壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布,，你的細(xì)胞之后會對你越來越不好,。

3.EDTA的作用。胰酶切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白,，而EDTA通過螯合Ca離子,，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和,。有的人在胰酶里添加一些EDTA,，或者對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA,。

4.PBS洗滌,。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作,，因?yàn)檠逯泻幸种埔让傅牡鞍?。對于一些難消化細(xì)胞,，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS,，因?yàn)檫@些離子也會抑制胰酶的活性,。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的干細(xì)胞，不需要配制如此溶液,。