1. 絕大部分干細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后,，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞,。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代,，對細胞傷害很大,。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去,，然后37℃消化,。比較難消化的細胞（潤洗方法5min還不能消化），這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育,。

2.細胞如何算是消化好了呢,？不是細胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細胞層,，只要能移動了,，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了,，很多人喜歡把細胞消化或者吹打成*分離細胞,，這是沒有必要的。一般能移動了,，說明細胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了,，細胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）,。這個時候應該停止消化,，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大,，才停止,。細胞就是*成單個干細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集,，這個是貼壁培養(yǎng)的細胞,，尤其是腫瘤細胞的一個特性。如果和標準形態(tài)不一致,，那可能是自己沒消化好導致的,，但如果消化方法正確，仍然成片分布,，甚至*吹打成單細胞懸液,，貼壁后仍然成片分布，這是細胞的特性,，是因為貼壁過程中重新聚集了,。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細胞之后會對你越來越不好,。

3.EDTA的作用,。胰酶切割ECM的一些負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子,，作用于Integrin的活性,，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA,，或者對付特別難消化的細胞,，添加多一些EDTA。

4.PBS洗滌,。消化之前用PBS洗滌,，是常見的操作，因為血清中含有抑制胰酶的蛋白,。對于一些難消化細胞,，那么可以配制不含Ca,，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制胰酶的活性,。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的干細胞,，不需要配制如此溶液。