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現(xiàn)代生物技術均通過細胞作為載體來進行,,無論是基因治療、干細胞,、克隆技術都在細胞內(nèi)進行的,。細胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境,用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質稱為培養(yǎng)基,,即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng),、保存細胞用的物質,就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境,,使細胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力,。它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質基礎。細胞培養(yǎng)基其組成成分主要有:水,、氨基酸,、維生素,、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物,、激素等,。
細胞培養(yǎng)基的基本要求
體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中,因此培養(yǎng)基應能滿足細胞對營養(yǎng)成分,、促生長因子,、激素、滲透壓,、pH等諸多方面的要求,。
1、營養(yǎng)成分
維持細胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面:
1)氨基酸:是細胞合成蛋白質的原料,。所有細胞都需要12種必須氨基酸:纈氨酸,、亮、異亮,、蘇,、賴、色,、苯丙,、蛋、組,、酪,、精氨酸、胱氨酸,。此外還需要谷氨酰胺,,它在細胞代謝過程中有重要作用,所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源,,同樣也是合成三,、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質,。
體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸,。
2)單糖:培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解,六碳糖是主要能源,。此外六碳糖也是合成某些氨基酸,、脂肪、核酸的原料,。細胞對葡萄糖的吸收能力,,半乳糖。
體外培養(yǎng)動物細胞時,,幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質,。
3)維生素:主要扮演輔酶,、輔基的角色,*,。生物素,、葉酸、煙酰胺,、泛酸,、吡哆醇、核黃素,、硫胺素,、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。
4)無機離子與微量元素:細胞生長除需要鈉,、鉀,、鈣、鎂,、氮和磷等基本元素,,還需要微量元素,如鐵,、鋅,、硒、銅,、錳,、鉬、釩等,。
2,、促生長因子及激素
各種激素,、生長因子對于維持細胞的功能,、保持細胞的狀態(tài)(分化或未分化)具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用,,如胰島素,,它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用,,如可促進表皮細胞的生長,,泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。
3,、滲透壓
細胞必須生活在等滲環(huán)境中,,大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓,。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右,。對于大多數(shù)哺乳動物細胞,,滲透壓在260-320mOsm/kg的范圍都適宜。
4,、無毒,、無污染
體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力,因此培養(yǎng)基應達到無化學物質污染,、無微生物污染(如細菌,、真菌、支原體,、病毒等),、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質污染(如抗體、補體),。對于天然培養(yǎng)基,,污染主要來源于取材過程及生物材料本身,應當嚴格選材,,嚴格操作,。對于合成培養(yǎng)基,污染主要來源于配制過程,,配制所用的水,,器皿應十分潔凈,配制后應嚴格過濾除菌,。
5,、PH
氣體也是細胞生存的必需條件之一,所需氣體豐要是氧和二氧化碳,。氧參與三羧酸循環(huán),,產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分,。一些細胞在缺氧情況下,,借糖酵解也可獲取能量,但多數(shù)細胞缺氧不能生存,。在開放培養(yǎng)時,,一般置細胞于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物,,也是細胞所需成分,,它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件,,pH值約在7.2~7.4℃在細胞生長過程中,,隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強,二氧化碳不斷被釋放,培養(yǎng)液變酸,,PH值發(fā)生變化,。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳,很不穩(wěn)定,,致使緩沖系統(tǒng)難以地控制,。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結合碳酸氫鈉使用,,可提供更有效的緩沖體系,,主要是防止pH值迅速變動,但大缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值,。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2,,在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結合產(chǎn)生碳酸,培養(yǎng)基pH很快下降,。為解決這一問題,,合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng),并采用開放培養(yǎng),,使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶,,再通過穩(wěn)定調節(jié)溫箱中CO2濃度(5%),與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài),。
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