一、主要步驟
①將冷凍管從液氮中取出,，迅速投入37℃水浴融化,，細(xì)胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時間延長會提高細(xì)胞死亡率,，復(fù)蘇過程中一般細(xì)胞死亡率在20%～25%之間,。
②迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒，然后放置在冰浴上,。
③小心開啟瓶蓋,，把細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱,，36℃～38℃培養(yǎng)1h,，讓細(xì)胞貼壁。
④細(xì)胞貼壁后,，小心移棄培養(yǎng)基,，主要是去掉DMSO(懸浮生長細(xì)胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細(xì)胞及其碎片,，加5mL新鮮培養(yǎng)基,，36℃～38℃培養(yǎng)。
⑤細(xì)胞培養(yǎng)24h后,，更換新鮮培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層，便可以傳代,。
⑥詳細(xì)記錄復(fù)蘇細(xì)胞的名稱,、數(shù)量、復(fù)蘇時間,、存放部位等,。

二、注意事項
1,、注意無菌操作,。
2、應(yīng)在1-2min內(nèi)使凍存液*融化,。如果復(fù)溫速度太慢,，則會造成細(xì)胞損傷。另外,，細(xì)胞復(fù)蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行,，以減少冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞的毒性。
3,、細(xì)胞復(fù)蘇過程中,，升溫的速率要大,，把從液氮或-70℃冰箱中取出的細(xì)胞在最短的時間內(nèi)放入水浴鍋。
4,、細(xì)胞放入水浴中注意用鑷子夾住細(xì)胞凍存管并在水浴中不時晃動,，使其受熱均勻，并防止水浴時水進(jìn)入細(xì)胞凍存管污染細(xì)胞,。打開細(xì)胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br/>5,、液氮操作有一定的危險性，打開液氮罐取出細(xì)胞時,，戴上防護(hù)眼鏡,。
6、如果凍存管密封不嚴(yán),，液氮可被吸入,。由于解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，將可能發(fā)生爆炸,。復(fù)蘇過程中應(yīng)蓋上恒溫水浴鍋的蓋,。