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雜質(zhì)分離方法開發(fā)過程
01 分析目的要求
開發(fā)一種合適的分析方法,，使上述3種化合物在濃度1.0mg/mL的情況下分離度大于1.50,。
開始方法開發(fā)之前,，第一件該做的事是什么呢,？
當(dāng)然是去了解這幾個(gè)物質(zhì)的性質(zhì),，盡可能的得到有關(guān)這些物質(zhì)的信息,，這樣可以為后面工作節(jié)省最多的時(shí)間,。而對這三個(gè)物質(zhì)得到的信息大致如下：三種物質(zhì)極性比較強(qiáng),，水溶性比較好，在常規(guī)C18色譜柱保留太弱,，基本上與溶劑峰重疊,。結(jié)構(gòu)式上主要是官能團(tuán)的差異，分別為-NH2,，-Br,，-COOH，差異性很大,。
綜合考慮,，有兩種方案：一是加離子對試劑，用反相C18色譜柱增強(qiáng)保留，進(jìn)行分離,；二是使用離子交換色譜柱進(jìn)行分離,。首先由于個(gè)人的習(xí)慣，離子交換色譜被我直接排除（離子色譜平衡比較慢,，而且離子交換色譜柱非常容易出現(xiàn)重現(xiàn)性問題）,。所以本實(shí)驗(yàn)采用C18添加離子對試劑的方法。
考慮的實(shí)驗(yàn)過程中需要使用離子對試劑,，且流動(dòng)相pH需要大范圍調(diào)整（可能用到堿性流動(dòng)相）,，所以色譜柱選擇月旭Xtimate® C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱,，流速：1.0mL/min,，柱溫30℃，檢測波長220nm,。
2.1 初步嘗試流動(dòng)相：0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀,，PH=4.60。
結(jié)果：化合物3保留時(shí)間2.6min,，化合物1不出峰,。估計(jì)是化合物1保留太強(qiáng)未洗脫下來。接下來,，調(diào)整pH并增加有機(jī)相的比例,，來加大洗脫能力。
2.2 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉,，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中,，用磷酸調(diào)pH=2.30）：甲醇=60：40。
混合對照圖譜如下：
實(shí)驗(yàn)中將庚烷磺酸鈉改為辛烷磺酸鈉,，增加有機(jī)相（甲醇）比例,，結(jié)果三個(gè)物質(zhì)分離良好，但是化合物1（19.9分鐘）峰型太差,，下一步優(yōu)化化合物1的峰型,。
2.3 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中,，用磷酸調(diào)pH=2.30）：乙腈=80：20,。
化合物1圖譜：
基于上一次實(shí)驗(yàn)，將有機(jī)相甲醇變?yōu)橐译?，通過改變選擇性看是否峰型會有改善,。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒有任何改善，而且發(fā)現(xiàn)這個(gè)方法中有機(jī)相只提供洗脫能力,，不提供選擇性改變作用,。
2.4 流動(dòng)相：緩沖液（緩沖液：1.00g十二烷基磺酸鈉,，50mM氯化銨至500mL水，用磷酸調(diào)pH=1.80）：甲醇=60：40,。
混合對照圖譜：
當(dāng)時(shí)換成這個(gè)流動(dòng)相的主要思路是,，加十二烷基磺酸鈉使保留更強(qiáng)，加氯化銨提高離子濃度,，調(diào)pH至1.80強(qiáng)酸性使化合物1中-NH2官能團(tuán)作用更弱,，達(dá)到優(yōu)化峰型的目的,，但是效果很差,。回頭總結(jié)發(fā)現(xiàn)我們所有的目光都聚焦在三種物質(zhì)的不同官能團(tuán)上,，導(dǎo)致越走越偏離分離的軌跡,，這里，三個(gè)物質(zhì)共同含有的官能團(tuán)可能也是影響分離的主要因素,，換了個(gè)角度后,，豁然開朗了。tui翻了之前的方案,，將離子對試劑換為四丁基氫氧化銨,，從頭開始。
2.5 流動(dòng)相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液,，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中,，用三乙胺調(diào)pH=9.30）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
流動(dòng)相中添加三乙胺和并將pH調(diào)成9.3目的是抑制化合物1的拖尾,，但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種物質(zhì)沒有分開,。繼續(xù)優(yōu)化條件將pH值降低。
2.6 流動(dòng)相：緩沖液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液,，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中,，用三乙胺調(diào)pH=7.00）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
看到這結(jié)果是不是項(xiàng)目就OK了,。但是既然是方法開發(fā),，方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)是bi不可少的，需要用一根新色譜柱重現(xiàn)該色譜條件,。
結(jié)果問題就來了.....
化合物1圖譜：
化合物1峰型一直分叉,，最終發(fā)現(xiàn)應(yīng)該是色譜柱使用多種離子對試劑，造成色譜柱改性,，新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果,。好吧，再開始,。
然后又是繼續(xù)摸索,。不得不說有時(shí)候運(yùn)氣也是成功的一部分,，在一次流動(dòng)相配置過程中，看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨,，突然我就冒出想法,，用四丁基溴化銨試試，不知道結(jié)果會怎么樣,，說做就做,。
2.7 流動(dòng)相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀,，1.0mL三乙胺至500mL高純水,。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
03 結(jié)果
結(jié)果：分離度,，峰型都滿足要求,，wan美。當(dāng)然還是需要重現(xiàn)方法的,。
三根新色譜柱重現(xiàn)結(jié)果：
最終色譜條件：
色譜柱：月旭Xtimate® C18（4.6*250mm,，5μm）。
流動(dòng)相：緩沖液（1.00g四丁基溴化銨,，1.36g磷酸二氫鉀,，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10）：乙腈=80：20
檢測波長：220nm,；
柱溫：30℃,；
流速：1mL/min；
進(jìn)樣體積：10μL,。
搞定交差,！
04 實(shí)驗(yàn)小結(jié)
在液相應(yīng)用方法開發(fā)過程中，首先需結(jié)合需要分離的目的,，確定思路,，一個(gè)方法最初的思路，是決定這個(gè)方法開發(fā)的效果,，效率的最根本因素,；其次是細(xì)節(jié)，任何細(xì)節(jié)都有可能導(dǎo)致你實(shí)驗(yàn)的成功與否,；最后是運(yùn)氣,，牛頓發(fā)現(xiàn)萬有引力還有運(yùn)氣成分呢，說不定你是下一個(gè),。
同時(shí),，在一個(gè)方法確定好之后，一定需要使用一根新的色譜柱來驗(yàn)證,，因?yàn)樵诜椒ㄩ_發(fā)過程中,，我們會使用到各種流動(dòng)相條件,，會對色譜柱一個(gè)改性，特別是使用離子對試劑的方法,，否則后續(xù)的重現(xiàn)性問題會是一個(gè)非常頭痛的事情,。