免疫細(xì)胞或組織化學(xué)染色的相關(guān)問(wèn)題

附上我們這里的組化步鄹：（切片復(fù)溫涼干完畢）

1,。加入配好的0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MPBS 20ml＋30%過(guò)氧化氫 1ml）30min,，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響,，0.01MPBS清洗5min×3；

2,。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100 1ml＋0.01MPBS 100ml）30min,，以增加細(xì)胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3,；

3,。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋疊氮納0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀釋的*抗體4℃反應(yīng)24-48h。吸去抗體,，0.01MPBS洗5min×3,；

4。加入血清稀釋液或0.01MPBS稀釋的二抗,，室溫孵育2h,。吸去二抗，0.01MPBS洗5min×3,；

5,。加入ABC復(fù)合物，室溫孵育2h,，0.01MPBS洗5min×3,，蒸餾水迅速?zèng)_三次；

6,。加入硫酸鎳銨溶液（DAB 25mg＋蒸餾水50ml＋硫酸鎳銨醋酸緩沖液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化銨40mg＋葡萄糖氧化酶1mg）,，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)顯色，時(shí)間不超過(guò)30min。不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察,，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液,，蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01MPBS終止反應(yīng)；

或直接加入配好的DAB溶液進(jìn)行顯色,。

7,。梯度酒精（70％、80％,、90％酒精5min×1,，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脫水之后,，二甲苯透明,，中性樹(shù)脂封片。
而對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞則比較簡(jiǎn)單：（細(xì)胞種在玻片上）

1,。固定液固定10－30min,，0.01MPBS清洗2min×3；

2,。羊血清封閉液封閉（可以加入0.3% Triton X100 ）30－60min分鐘,；

3。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋疊氮納0.08g＋30% Triton X100 1ml）稀釋的*抗體室溫反應(yīng)1－2h或4℃過(guò)夜,。吸去抗體,，0.01MPBS洗2min×3；

4,。加入血清稀釋液或0.01MPBS稀釋的二抗,，室溫孵育1h。吸去二抗,，0.01MPBS洗2min×3,；（如果是熒光二抗就可以直接用50％甘油封片，進(jìn)行觀(guān)察了）

5,。加入ABC復(fù)合物,，室溫孵育1h，0.01MPBS洗2min×3,，蒸餾水迅速?zèng)_三次,；

6。加入硫酸鎳銨溶液（DAB 25mg＋蒸餾水50ml＋硫酸鎳銨醋酸緩沖液50ml＋葡萄糖200mg＋氯化銨40mg＋葡萄糖氧化酶1mg）,，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)顯色,，時(shí)間不超過(guò)30min。不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察,，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01MPBS終止反應(yīng),；

或直接加入配好的DAB溶液進(jìn)行顯色,。

7,。梯度酒精（70％、80％,、90％酒精5min×1,，95％酒精5min×2，100％酒精5min×3）脫水之后,，50％明膠封片,。
1。脫片--
a）切片和貼片一定要過(guò)關(guān),；
b）冰凍切片從冰箱中拿出必須復(fù)溫并涼干（室溫1－2h）,；
c）清洗切片時(shí)應(yīng)放在切片缸內(nèi)，沿缸壁倒入PBS,，靜置5－10min,，沒(méi)有晃動(dòng)的必要。

2,。染色背景太深,，而且沒(méi)有陽(yáng)性顯色--
a）灌注要要過(guò)關(guān)；
b）需用3％雙氧水甲醇溶液浸泡切片,；
c）需用0.3-0.4%的triton溶液浸泡切片,；
d）延長(zhǎng)羊血清封閉時(shí)間；
e）降低一抗的濃度,；（我有一次就是用了較高的一抗?jié)舛?，結(jié)果沒(méi)有染出東西，但是降低一抗?jié)舛群?，結(jié)果非常好,，其實(shí)這就是抗體的“prozone”--前區(qū)現(xiàn)象）

3。蘇木素復(fù)染