使用熒光底物的直接 ELISA 實驗方案

使用熒光底物的直接 ELISA 實驗方案] 實驗步驟 第 1 天：1.在濾過的 PBS 中稀釋包被抗體后,，在每孔中加入 100 μl 進行包被。用封板膜覆蓋酶標板,，將酶標板在 4℃下孵育一夜,。  第 2 天：2.將 4 g Block ACE 粉末稀釋于 100 ml 去離子水中，使用其 1:4 稀釋液在每孔中加入 200 μl,，在室溫下封閉酶標板 3 小時,，封閉期間用封板膜覆蓋酶標板。3.洗滌酶標板：PBS-T (0.05%  [熒光底物 直接 ELISA 熒光 抗體 包被]

實驗步驟

第 1 天：

1.在濾過的 PBS 中稀釋包被抗體后,，在每孔中加入 100 μl 進行包被,。用封板膜覆蓋酶標板，將酶標板在 4℃下孵育一夜,。

第 2 天：

2.將 4 g Block ACE 粉末稀釋于 100 ml 去離子水中,，使用其 1:4 稀釋液在每孔中加入 200 μl，在室溫下封閉酶標板 3 小時,，封閉期間用封板膜覆蓋酶標板,。

3.洗滌酶標板：PBS-T (0.05% Tween20) 250 μl/孔；3x 30 s,。

在洗滌或抽吸后,，將酶標板翻轉(zhuǎn)置于工作臺的無塵紙上以除去多余的液體。

4.取 100 μl 剛剛在 10% BlockACE 的 PBS-T 溶液中稀釋的標準品或樣品,，上樣到酶標板,，并在 4℃下孵育一夜，孵育期間用封板膜覆蓋酶標板,。

提前制備標準品,。
在將標準品上樣到酶標板的當天（第二天），現(xiàn)將標準品在例如 10% BSA 的 PBS-T 溶液中稀釋,，稀釋至 10 ng/ml 至 500 pg/ml

第 3 天：

5.以 100 μl/孔的量添加稀釋于 PBS 中的生物素化報告抗體,，在室溫下孵育 2 小時，孵育期間用封板膜覆蓋酶標板,。

6.以 100 μl/孔的量添加以 1:5000 稀釋于 PBS 中的鏈霉親和素堿性磷酸酶,，在室溫下孵育 1 小時，孵育期間用封板膜覆蓋酶標板,。

7.洗滌酶標板：TBS 250 μl/孔,；3x 30 s。

8.以 100 μl/孔的量添加 AttoPhos 熒光底物系統(tǒng),，在室溫下孵育 5-10 分鐘,，使信號放大。使用前應(yīng)將 36 mg AttoPhos 底物與 60 ml AttoPhos 緩沖液混合 24 小時。確?？赘蓛魺o污染,。

9.在熒光計（Perkin Elmer 生產(chǎn)的 Victor2）上測定信號；激發(fā)波長：440 nm,；發(fā)射波長：550 nm,。