單克隆抗體制備過(guò)程與原理

單克隆抗體(MAb)是針專一的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體，單克隆技術(shù)又名雜交瘤技術(shù)起源于1975年,，由G.KÖhler和Milstein創(chuàng)立,。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞雜交融合成雜交瘤細(xì)胞,，生產(chǎn)抗體,。單克隆抗體制備過(guò)程有以下幾個(gè)步驟，下面講簡(jiǎn)要介紹,。

1,、免疫動(dòng)物 免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過(guò)程,。 一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠,，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官,，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆,，使其活化、增殖,，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞,。

2、細(xì)胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠,，無(wú)菌操作取出脾臟,，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液,。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合,，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合,，形成雜交瘤細(xì)胞,。

3、選擇性培養(yǎng) 選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞,，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基,。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡,。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡,。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖,。

4,、雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化 在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞,，因此,，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng),。采用靈敏,、快速、特異的免疫學(xué)方法,，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型,、亞類,、特異性、親和力,、識(shí)別抗原的表位及其分子量后,，及時(shí)進(jìn)行凍存。

5,、單克隆抗體的大量制備 單克隆抗體的大量制備重要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法,。

(1)體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理,。1-2周后,，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖,，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體,。約1-2周,，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水,，即可獲得大量單克隆抗體,。

(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中,，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體,，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片,，即可獲得所需要的單克隆抗體,。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來(lái),，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn),，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。雜交瘤細(xì)胞融合后,，要進(jìn)行篩選后才能使用,。雜交瘤細(xì)胞分為兩次：一、篩選出雜交瘤細(xì)胞;二,、在初選的雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜家瘤細(xì)胞,，這兩次篩選的方法和原理各不相同。

以上五個(gè)步驟簡(jiǎn)要概述了單克隆抗體制備過(guò)程,。下面再介紹一下單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)原理,。要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng),。而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖,，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到種的骨髓瘤細(xì)胞,。這種種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性,，也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性,，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體,。