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測(cè)定意義

鐵元素是一種十分重要的植物營(yíng)養(yǎng)元素,，土壤中鐵含量直接影響著植物吸收利用以及生長(zhǎng)代謝,。

測(cè)定原理

在pH2-9范圍內(nèi),，鹽酸羥胺將三價(jià)鐵轉(zhuǎn)化為二價(jià)鐵,，與鄰菲羅琳反應(yīng)生成橙紅色配合物,，在510nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平,、常溫離心機(jī),、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板,。

試劑一：液體×1瓶,，室溫保存。

試劑二：液體×1瓶,，4℃保存,。              

試劑三：粉劑×2瓶，－20℃保存,。臨用前加入22mL試劑二,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

試劑四：液體×1支，4℃保存,。

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿,。16000g，4℃離心20min,，取上清置冰上待測(cè),。

2、細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時(shí)間3min）；16000g,， 4℃離心20min,，取上清液置冰上待測(cè)。

3,、血清等液體：直接測(cè)定,。

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。

ADH (nmol/min/g鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每104個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位,。

ADH (nmol/min/104cell) =(△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T

=1608×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，100μL=0.1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間,，1min,。