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特異性標記,、純化ER駐留蛋白的試劑盒

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更新時間:2020-09-30 17:11:17瀏覽次數:1086

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產品簡介

供貨周期 一個月以上 應用領域 生物產業(yè)
特異性標記、純化ER駐留蛋白的試劑盒
ER-Protein Capture Kit
ER-Protein Capture kit是一款利用熒光標記物特異性標記ER駐留蛋白,,再使用標簽捕獲抗體通過免疫沉淀法純化標記蛋白的試劑盒,。可用于ER相關蛋白的全面鑒定與定量分析有或無刺激(例如內質網應激)下靶蛋白的ER駐留量,。

詳細介紹

特異性標記,、純化ER駐留蛋白的試劑盒

ER-Protein Capture Kit

 

 

ER-Protein Capture kit是一款利用熒光標記物特異性標記ER駐留蛋白,再使用標簽捕獲抗體通過免疫沉淀法純化標記蛋白的試劑盒,??捎糜贓R相關蛋白的全面鑒定與定量分析有或無刺激(例如內質網應激)下靶蛋白的ER駐留量。

 

 本產品是funakoshi基于京都大學工學研究科浜地格教授,、田村朋則講師的研究成果商品化銷售的產品,。

 本產品僅供研究使用。研究以外不可使用,。

 

◆ER蛋白的回收方法與問題點

ER (內質網,;Endoplasmic Reticulum)是一種通常在細胞內占據約20%體積的細胞器,,結構非常復雜且遍布整個細胞。ER是負責細胞內蛋白質生物合成的中央細胞器,,在多肽鏈合成,、通過伴侶蛋白適當折疊、排除異常蛋白等,,從生物合成到品質管理中起著重要作用,。ER還擔任分泌路徑的一部分,是細胞膜蛋白和細胞外分泌蛋白通過的細胞器,。另外,,它還被認為對于脂質代謝和脂肪滴形成十分重要,因此能夠分離,、鑒定并定量分析ER蛋白的方法備受期待,。然而,不同于其他細胞器,,特異性純化ER的的技術十分貧乏,,選擇性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大學浜地格教授,、田村朋則講師等開發(fā)的基于ER駐留蛋白標記技術商品化的ER蛋白選擇性標記,、純化試劑盒。通過使用ER駐留蛋白標記試劑ERM ER-localizable Reactive Molecule),,可以利用熒光標記物標記ER駐留蛋白,,然后通過針對該標記物的特異性抗體進行純化,選擇性回收ER蛋白,。無需超速離心機等特殊的機器,,僅需簡單操作便可純化ER蛋白。除了能夠通過蛋白組學進行全面鑒定外,,本產品還適用于相對定量分析各種刺激處理下的ER駐留量,。

 

◆試劑盒內容

本試劑盒由兩部分組成。

A:ER駐留蛋白標記試劑ERM

A:(本試劑與產品名稱為ERseeing,、產品編號FDV-0038為同一試劑,。可單獨購買,,也可以用作ER成像試劑)

B:標簽捕獲抗體(純化兔多克隆IgG抗體)

A:※ 產品不包含用于細胞裂解液制備用的溶解緩沖液或免疫沉淀所需的Protein A / G樹脂等,。請另行購買。

 

◆原理和實驗流程

ER駐留蛋白標記試劑ERM是一種在ER駐留性綠色熒光色素(Rhodol衍生物)上綴合蛋白標記基團的化合物,。將ERM添加到活細胞后,,由于色素部分的特性,顯示出較高的ER駐留性,。在ER中迅速濃縮后,,通過蛋白標記基團用熒光標記物標記ER蛋白物(Step-1),。標記反應后破碎細胞制備細胞裂解液(Step-2),然后通過使用標簽捕獲抗體(抗Rhodol抗體)進行免疫沉淀(Step-3),,可以選擇性地回收被ERM標記的ER蛋白,。由于回收的蛋白上帶有熒光基團,,使用SDS-PAGE分離后,,可以通過CBB/銀染或熒光成像儀檢測出來(Step-4)。進行SDS-PAGE分離后,,可以通過LC / MS進行全面蛋白組學分析或使用任何抗體的蛋白印跡法鑒定ER蛋白,。

 

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◆原著論文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060~17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

 

◆實驗參考數據

 

■ ERM的激發(fā)/發(fā)射光譜

■ 激發(fā)光譜(藍)以及發(fā)射光譜(綠)

■ ※ 適用于普通的綠色熒光色素FITC觀察條件

 

 

■ ER特異性檢驗

■ 通過與各種細胞器標記共染色評價本試劑的ER特異性。觀察到ERM(100 nM)與ER標記試劑高度共定位(皮爾遜相關系數>0.9),。另一方面,,未觀察到本試劑與溶酶體標記、線粒體標記的共定位,。高爾基體標記觀察到部分共定位,,應該是因為本試劑所標記的蛋白通過Golgi體運輸從ER轉移至分泌路徑。此外,,添加ER-Golgi運輸抑制劑的話,,會減少與高爾基體的共定位(詳細請參考原著論文)。

 

應用實例

通過蛋白組學全面分析回收蛋白

使用ERM (100 nM)處理HeLa細胞后,,破碎細胞制備細胞裂解液,。在裂解液中加入標簽捕獲抗體,使用Protein A磁珠進行免疫沉淀回收標記蛋白,。將回收的蛋白通過SDS-PAGE分離后,,切出每個條帶,在凝膠中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制備LC/MS樣品,。通過MS分析鑒定出共146種蛋白,,其中63種蛋白是數據庫上的ER蛋白,或是個別論文中確認了ER駐留的蛋白,。73種蛋白作為細胞膜,、細胞外分泌蛋白以及高爾基體蛋白被鑒定出來,它們都是存在于細胞外分泌路徑的蛋白,。由于存在于細胞外分泌途徑的蛋白會途經ER,,當這些蛋白在ER的時候便會被標記。因此,,檢測出來的蛋白中ER蛋白與途經ER的蛋白約占93%,。本實驗中檢測出與ER無關的蛋白有10種,約占7%,。

 

 

R應激引起的ER駐留蛋白變動量的定量評價

通過SILAC定量分析法分析ER應激誘導的ER駐留蛋白的變動量,。準備兩份細胞,,一份在SILAC Heavy標記培養(yǎng)基中培養(yǎng),另一份在Light標記培養(yǎng)基中培養(yǎng),。在Heavy標記培養(yǎng)基的細胞中添加ER應激誘導試劑Tunicamycin培養(yǎng)4 h,。而Light標記培養(yǎng)基無需任何處理培養(yǎng)4 h。之后,,使用ERM(100 nM)處理1 h,,分別制備細胞裂解液,再以1:1的比例混合,。通過免疫沉淀法回收混合裂解液中的標記蛋白,,然后與上述實驗一樣,制備LC/MS用樣品,。檢測出了87種可相對定量的蛋白,,再通過SILAC法算出由ER應激引起的變動量。其中6種蛋白因ER應激在ER上的存在量增加了兩倍以上,。

 

 

 產品列表 

產品編號產品名稱包裝
 FDV-0039 ER-Protein Capture Kit 1 Kit

 

 特異性標記,、純化ER駐留蛋白的試劑盒

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