特異性標記、純化ER駐留蛋白的試劑盒
ER-Protein Capture Kit
ER-Protein Capture kit是一款利用熒光標記物特異性標記ER駐留蛋白,，再使用標簽捕獲抗體通過免疫沉淀法純化標記蛋白的試劑盒,。可用于ER相關蛋白的全面鑒定與定量分析有或無刺激（例如內質網應激）下靶蛋白的ER駐留量,。

特異性標記,、純化ER駐留蛋白的試劑盒

ER-Protein Capture Kit

 

 

ER-Protein Capture kit是一款利用熒光標記物特異性標記ER駐留蛋白，再使用標簽捕獲抗體通過免疫沉淀法純化標記蛋白的試劑盒,?？捎糜贓R相關蛋白的全面鑒定與定量分析有或無刺激（例如內質網應激）下靶蛋白的ER駐留量。

 

※　本產品是funakoshi基于京都大學工學研究科浜地格教授,、田村朋則講師的研究成果商品化銷售的產品,。

※　本產品僅供研究使用。研究以外不可使用,。

 

◆ER蛋白的回收方法與問題點

ER （內質網,；Endoplasmic Reticulum）是一種通常在細胞內占據約20%體積的細胞器,，結構非常復雜且遍布整個細胞。ER是負責細胞內蛋白質生物合成的中央細胞器,，在多肽鏈合成,、通過伴侶蛋白適當折疊、排除異常蛋白等,，從生物合成到品質管理中起著重要作用,。ER還擔任分泌路徑的一部分，是細胞膜蛋白和細胞外分泌蛋白通過的細胞器,。另外,，它還被認為對于脂質代謝和脂肪滴形成十分重要，因此能夠分離,、鑒定并定量分析ER蛋白的方法備受期待,。然而，不同于其他細胞器,，特異性純化ER的的技術十分貧乏,，選擇性回收ER蛋白并不容易。

ER Protein Capture Kit是由京都大學浜地格教授,、田村朋則講師等開發(fā)的基于ER駐留蛋白標記技術商品化的ER蛋白選擇性標記,、純化試劑盒。通過使用ER駐留蛋白標記試劑ERM （ER-localizable Reactive Molecule）,，可以利用熒光標記物標記ER駐留蛋白,，然后通過針對該標記物的特異性抗體進行純化，選擇性回收ER蛋白,。無需超速離心機等特殊的機器,，僅需簡單操作便可純化ER蛋白。除了能夠通過蛋白組學進行全面鑒定外,，本產品還適用于相對定量分析各種刺激處理下的ER駐留量,。

 

◆試劑盒內容

本試劑盒由兩部分組成。

A：ER駐留蛋白標記試劑ERM

A：（本試劑與產品名稱為ERseeing,、產品編號FDV-0038為同一試劑,。可單獨購買,，也可以用作ER成像試劑）

B：標簽捕獲抗體（純化兔多克隆IgG抗體）

A：※ 產品不包含用于細胞裂解液制備用的溶解緩沖液或免疫沉淀所需的Protein A / G樹脂等,。請另行購買。

 

◆原理和實驗流程

ER駐留蛋白標記試劑ERM是一種在ER駐留性綠色熒光色素（Rhodol衍生物）上綴合蛋白標記基團的化合物,。將ERM添加到活細胞后,，由于色素部分的特性，顯示出較高的ER駐留性,。在ER中迅速濃縮后,，通過蛋白標記基團用熒光標記物標記ER蛋白物（Step-1）,。標記反應后破碎細胞制備細胞裂解液（Step-2），然后通過使用標簽捕獲抗體（抗Rhodol抗體）進行免疫沉淀（Step-3）,，可以選擇性地回收被ERM標記的ER蛋白,。由于回收的蛋白上帶有熒光基團,，使用SDS-PAGE分離后,，可以通過CBB/銀染或熒光成像儀檢測出來（Step-4）。進行SDS-PAGE分離后,，可以通過LC / MS進行全面蛋白組學分析或使用任何抗體的蛋白印跡法鑒定ER蛋白,。

 

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◆原著論文

Fujisawa et al., J. Am. Chem. Soc., 140, 17060～17070 (2018). Chemical Profiling of the Endoplasmic Reticulum Proteome Using Designer Labeling Reagents.

 

◆實驗參考數據

 

■ ERM的激發(fā)/發(fā)射光譜

■ 激發(fā)光譜（藍）以及發(fā)射光譜（綠）

■ ※ 適用于普通的綠色熒光色素FITC觀察條件

 

 

■ ER特異性檢驗

■ 通過與各種細胞器標記共染色評價本試劑的ER特異性。觀察到ERM（100 nM）與ER標記試劑高度共定位（皮爾遜相關系數>0.9）,。另一方面,，未觀察到本試劑與溶酶體標記、線粒體標記的共定位,。高爾基體標記觀察到部分共定位,，應該是因為本試劑所標記的蛋白通過Golgi體運輸從ER轉移至分泌路徑。此外,，添加ER-Golgi運輸抑制劑的話,，會減少與高爾基體的共定位（詳細請參考原著論文）。

 

◆應用實例

通過蛋白組學全面分析回收蛋白

使用ERM (100 nM)處理HeLa細胞后,，破碎細胞制備細胞裂解液,。在裂解液中加入標簽捕獲抗體，使用Protein A磁珠進行免疫沉淀回收標記蛋白,。將回收的蛋白通過SDS-PAGE分離后,，切出每個條帶，在凝膠中用胰蛋白酶/ Lys-C消化制備LC/MS樣品,。通過MS分析鑒定出共146種蛋白,，其中63種蛋白是數據庫上的ER蛋白，或是個別論文中確認了ER駐留的蛋白,。73種蛋白作為細胞膜,、細胞外分泌蛋白以及高爾基體蛋白被鑒定出來，它們都是存在于細胞外分泌路徑的蛋白,。由于存在于細胞外分泌途徑的蛋白會途經ER,，當這些蛋白在ER的時候便會被標記。因此,，檢測出來的蛋白中ER蛋白與途經ER的蛋白約占93%,。本實驗中檢測出與ER無關的蛋白有10種，約占7%,。

 

 

R應激引起的ER駐留蛋白變動量的定量評價

通過SILAC定量分析法分析ER應激誘導的ER駐留蛋白的變動量,。準備兩份細胞,，一份在SILAC Heavy標記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另一份在Light標記培養(yǎng)基中培養(yǎng),。在Heavy標記培養(yǎng)基的細胞中添加ER應激誘導試劑Tunicamycin培養(yǎng)4 h,。而Light標記培養(yǎng)基無需任何處理培養(yǎng)4 h。之后,，使用ERM（100 nM）處理1 h,，分別制備細胞裂解液，再以1:1的比例混合,。通過免疫沉淀法回收混合裂解液中的標記蛋白,，然后與上述實驗一樣，制備LC/MS用樣品,。檢測出了87種可相對定量的蛋白,，再通過SILAC法算出由ER應激引起的變動量。其中6種蛋白因ER應激在ER上的存在量增加了兩倍以上,。

 

 

 ◆產品列表 

產品編號	產品名稱	包裝
FDV-0039	ER-Protein Capture Kit	1 Kit

 

 特異性標記,、純化ER駐留蛋白的試劑盒