聚丙稀酰胺等電聚焦電泳

目的要求

1,、學(xué)習(xí)等電聚焦的原理

2,、掌握聚丙烯酰胺等點(diǎn)聚焦電泳操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)原理

    所有的氨基酸均為兩性物質(zhì),，即它們至少含有一個(gè)羧基（carboxyl）及一個(gè)氨基（a-ami-no）,。 這些可游離的基團(tuán)隨著pH變化可以三種形式存在，即在電荷（cation）,、兩性離子（zwit-terion）及負(fù)電荷（anion）等三種,，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負(fù)電荷,。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0,，且在電場(chǎng)中不移動(dòng)時(shí)，稱此pH值為它的pI值（等電點(diǎn)）,。因?yàn)閮綦姾蔀榱?，凈電斥力不存在的緣故，大部分蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的pH值下,，其溶解度zui小,。相反的，當(dāng)溶液的pH值低于或高于pI,所有蛋白質(zhì)分子所帶凈電電荷為同號(hào),，彼此之間有相斥力,，不會(huì)聚焦。所以,，將pH調(diào)到等電點(diǎn)的大小,，則大部分的蛋白質(zhì)將會(huì)沉淀，這種現(xiàn)象可以應(yīng)用于估算某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),。另一方面,，也可以應(yīng)用在電泳，達(dá)到分離蛋白質(zhì)混合物的目的,，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric  focusing）,，簡(jiǎn)稱為IEF。

    以A,、B兩種蛋白質(zhì)為例,，做出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環(huán)境中的pH值,，縱軸代表蛋白質(zhì)的凈電荷,，在pH6.5時(shí)，A帶有兩個(gè)正電荷,，B帶有一個(gè)負(fù)電荷,。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5,，這就是它們的等電點(diǎn)。

    IEF是在具有pH梯度環(huán)境中進(jìn)行的電泳,。將蛋白質(zhì)置于不同pH梯度的膠體進(jìn)行電泳,，它會(huì)朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)，直到抵達(dá)等電點(diǎn)（pI）相同的pH值處才停止,，如果它移到別的pH處,，會(huì)因?yàn)閹щ姸俣纫苿?dòng)到和它pI相符的pH處。

    IEF-PAGE操作簡(jiǎn)單,，只要一般電泳設(shè)備就可進(jìn)行,，電泳時(shí)間短、分別率高,、應(yīng)用范圍廣,，可用于分離蛋白質(zhì)及測(cè)定pI，也可用于臨床鑒別診斷,、農(nóng)業(yè),、食品研究等各種領(lǐng)域。

試劑和器材

1,、試劑

    Acr-Bis貯存液：29.1g  Acr,，0.9g  Bis，用無(wú)離子水溶解后定容至100mL,，不溶物過(guò)濾去除后置棕色瓶,，貯于冰箱。

   等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白（pH3～10）試劑盒,，臨用前稀釋至0.1～0.3mg/mL,。

   適合于pH3～pH10范圍的電極溶液：

（1）、陰極電極溶液（1mol/L,、NaOH）,。稱NaOH（AR）4g，加去離子水使其溶解,，冷卻至室溫再定容至100mL,。

（2）、陽(yáng)極電極溶液（1mol/L,、H3PI4）,。取H3PO4（85%）6.7mL，加去離子水定容至100mL,。

固定液：稱取磺基水楊酸3.5g,，三氯乙酸10mL，甲醇35mL,，加去離子水至100mL,。

染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250,、0.1，冰乙酸10mL,，甲醇35mL,，加去離子水使其*溶解，再定容至100mL,，過(guò)濾后置棕色瓶保存,。

脫色液：取無(wú)水乙醇50mL，冰乙酸20mL,，加蒸餾水至200mL,。

保存液：取無(wú)水乙醇25mL,，冰乙酸10mL,，甘油5mL，加蒸餾水至100mL,。

10%過(guò)硫酸銨,，TEMED，40%兩性電解質(zhì)載體（pH3～10）,。

2,、材料

    待測(cè)已純化的蛋白質(zhì)樣品（脫鹽），濃度0.5mg/mL,。

3,、器材

    等電聚焦電泳槽，移液管（1,，5,10mL）,，燒杯（25,50,100mL）細(xì)長(zhǎng)頭的吸管，微量注射器（10uL或者50uL）,，漏斗,，濾紙，鑷子,。

操作方法

1,、準(zhǔn)備工作

    配制凝膠前，應(yīng)把玻璃板準(zhǔn)備好,。即將兩塊干凈的玻璃板疊放在一起,，之間夾上所需凝膠厚度的膠條進(jìn)行密封。然后用文具夾將玻璃板四周固定好,。注意夾子作用力點(diǎn)在膠條正中,，以防漏膠。

2,、配制凝膠

    取Acr-Bis貯備液2.0mL,；兩性電解質(zhì)0.5mL,；去離子水5.5mL；TEMED  8uL置于小燒杯中混勻,，再加入10%過(guò)硫酸銨50uL,，用磁力攪拌器充分混勻2min。然后用注射器吸凈混合液,，排除氣泡,，緩緩注入玻璃板的夾隙內(nèi)，注意勿出現(xiàn)氣泡,。

3,、電泳

（1）、,、剝膠板,。將膠板取出，揭去上層的玻璃板和膠條,，然后用蒸餾水輕輕沖洗一下膠面,。

（2）、點(diǎn)樣,。用小紙條（0.5cm×0.5cm）蘸上,，均勻地點(diǎn)在膠板上，點(diǎn)樣要求整齊,、迅速,。注意膠板兩邊要留出一定空間。通常把p1在酸性范圍的樣品放在偏堿性的位置（負(fù)極）,，P1偏酸性的樣品放在偏酸性的位置（正極）,，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合樣品放在中間。

（3）,、進(jìn)樣,。將浸入電極液的濾紙條取出，使其分別平直緊貼在膠面兩端,，然后放入電泳槽內(nèi),，注意正負(fù)極相吻合。將電極板正極（電極條浸有H3PO4的一側(cè)）與負(fù)極（電極條浸有NaOH的一側(cè))分別與電泳儀的正,、負(fù)極鏈接,。接通冷卻水，在室溫下電泳,，把電泳儀調(diào)至電壓50V,，電流以每板膠不超過(guò)17mA為準(zhǔn)，然后開(kāi)始電泳,。進(jìn)樣時(shí)間一般在1.5～2h,。

（4）,、揭樣紙。待電流降至每板膠3mA以下時(shí),，切斷電源,，取出膠板，揭去加樣紙后,，將電壓調(diào)至220～320V斷續(xù)電泳,。

（5）、加壓,。當(dāng)電流降至每板膠3mA以下時(shí),，升高電壓至580V，繼續(xù)電泳1.5h左右,。

（6）,、電流降至每板3mA以下時(shí)，切斷電源,，停止電泳,。

4,、固定,、染色和脫色

    將凝膠板放在培養(yǎng)皿中，加入固定液,，浸泡數(shù)小時(shí)后,，用脫色液清洗兩次，每次10min,，然后加入染色液,，室溫下放置15～30min，再用脫色液洗脫數(shù)次,，直至譜帶清晰,，放入保存液中浸泡10min，可制干板,。

5,、制作干膠板

（1）、取*浸濕的平整玻璃紙一張,，于玻璃板上鋪平,，紙與板之間不可有氣泡。

（2）,、將凝膠鋪于上述玻璃紙上,，對(duì)齊中心位置，使四邊留出距離相等,，隨后將膠與紙之間的氣泡輕輕趕跑,。然后,，把另一張玻璃紙折起蓋在膠面上，并與下層玻璃紙對(duì)齊,，膠與兩層玻璃紙之間要避免氣泡,，要求光滑平整。

（3）,、將凝膠四邊上下兩層玻璃紙貼緊,，使膠邊邊緣上*沒(méi)有氣泡。然后將各邊的玻璃紙多余部分折向玻璃板反面,。

（4）,、置于室溫中自然干燥，*干燥后的膠板,，手感如觸及玻璃板,。這時(shí)，可將膠板揭下,，截去邊角多余的紙,，即可得一張圖譜清晰的干膠板。

注意事項(xiàng)

（1）,、支持介質(zhì),。在IRF-PAGE中，丙烯酰胺純度極為重要,，Acr及Bis中如有丙烯酸,，則引起聚焦后pH梯度漂移，一般需用重結(jié)晶法進(jìn)一步純化Acr及Bis,。zui近,，Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果較再結(jié)晶法更佳,。

（2）,、兩性電解質(zhì)載體。兩性電解質(zhì)載體是IEF-PAGE中zui關(guān)鍵的試劑,，直接影響pH梯度的形成以及蛋白質(zhì)的聚焦,。因此，要選用的兩性電解質(zhì)載體,，在凝膠中,，其終濃度一般為1%～2%。pH梯度的線性依賴于兩性電解質(zhì)的性質(zhì),，選擇哪種pH梯度范圍的兩性電解質(zhì)載體,，則與被分離蛋白質(zhì)的pI有關(guān)。

（3）、樣品預(yù)處理與加樣方法,。實(shí)驗(yàn)證實(shí),，鹽離子可干擾pH梯度形成，并使區(qū)帶扭曲,。為了防止上述影響,，進(jìn)行IEF-PAGE時(shí)，樣品應(yīng)透析或用Sephadex  G-25脫鹽,，也可將樣品溶解在水,，或是低鹽緩沖液中，使其充分溶解,，以免不溶小顆粒引起拖尾,。但某些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近，或水溶液及低鹽溶液中,，溶解度較低,，則可在樣品中加入兩性電解質(zhì)，如加入1%甘氨酸或?qū)?%甘氨酸透析,。雖然甘氨酸是兩性電解質(zhì),，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極距作用增加蛋白質(zhì)的溶解性,。此外,，還可在樣品及凝膠溶液中加入無(wú)離子去污劑如Tween 80，Triton  X-100,，Nonide P-40等或加入相同濃度的尿素（4mol/L）,，以免氰酸鹽引起蛋白質(zhì)的氨甲酰化,，含有尿素的樣品及凝膠板只能當(dāng)天使用。

     加樣量取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類,、數(shù)目及檢測(cè)方法的靈敏度,。如用銀染色，加樣量可減少到1ug,。一般樣品濃度以0.5～3mg/mL為宜,，zui適加樣體積為10～30uL。如樣品很濃,，可直接在凝膠表面加2～5uL,；如樣品很稀，可加樣300uL,。值得注意的是：對(duì)不穩(wěn)定的樣品可先將凝膠進(jìn)行15～30min預(yù)電泳,，使pH梯度形成，然后將樣品放再靠近pI的位置以縮短電泳的時(shí)間,，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽(yáng),、陰極的膠面上,，以免引起蛋白質(zhì)變性造成區(qū)帶扭曲。一般加樣電泳半小時(shí)后,，取出加樣濾紙以免引起拖尾現(xiàn)象,。

（4）、電功率,、時(shí)間等因素,。在IEF電泳中，隨著樣品的遷移越接近pI時(shí),，電流則越來(lái)越小,。為使各成分能更好地分離，要保持一定的電功率,，就應(yīng)不斷增加電壓,，電壓增高可縮短PH梯度形成，和蛋白質(zhì)分離所需的時(shí)間,，但過(guò)高的電壓會(huì)使凝膠板局部范圍過(guò)熱,。因此，在電泳過(guò)程中,，應(yīng)通冷卻水,，水溫以4～10℃為宜，流量5～10L/min,。一般寬pH范圍電泳時(shí)間以1.5～2h為宜,。