單向定量免疫電泳

目的要求

  了解單向定量免疫電泳的基本原理和方法

實(shí)驗(yàn)原理

    單向定量免疫電泳又稱火箭電泳（rocket  immunoelectrophoresis）,。在瓊脂內(nèi)摻入適量的抗體，在電場(chǎng)作用下,，定量的抗原泳動(dòng)遇到瓊脂內(nèi)的抗體,，形成抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來(lái)。走在后面的抗原繼續(xù)在電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng),，遇到瓊脂內(nèi)沉淀的抗原-抗體復(fù)合物,，抗原量的增加造成抗原過(guò)量，使復(fù)合物沉淀溶解,，一同向正極移動(dòng)而進(jìn)入新的瓊脂內(nèi)與未結(jié)合的抗體結(jié)合,，又形成新的抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來(lái)，不斷地沉淀-溶解-再沉淀,，直至全部抗原和抗體結(jié)合,，在瓊脂內(nèi)形成錐形的沉淀峰，稱火箭電泳,?；鸺宓拈L(zhǎng)度與標(biāo)準(zhǔn)抗原比較，可計(jì)算待測(cè)抗原的濃度,。

    本實(shí)驗(yàn)以人血清作為抗原,，免疫動(dòng)物（家兔）產(chǎn)生抗血清，當(dāng)適量抗原,、抗體在瓊脂糖中擴(kuò)散,，兩者相遇時(shí)，則形成抗原抗體復(fù)合物的白色沉淀線,。不同的抗原分子與相應(yīng)的抗體分子的擴(kuò)散速度不同,，當(dāng)兩者間比例適當(dāng)時(shí)，出現(xiàn)數(shù)目不同的沉淀線,，根據(jù)沉淀線的出現(xiàn)可以定性抗原、診斷疾病或測(cè)定抗體的效價(jià),。

試劑和器材

1,、試劑

    抗原：甲胎球蛋白（1～5mg/mL）。

    免疫血清（抗血清）：家兔抗人甲胎球蛋白血清,。

    瓊脂糖（或進(jìn)口分裝瓊脂粉）,。

    pH8.6電極緩沖液（巴比妥緩沖液）離子程度0.05u：取巴比妥1.84g，巴比妥鈉10.3g溶于蒸餾水,，定溶至1L,。制備瓊脂溶液時(shí)需要將上述緩沖稀釋1倍,，離子強(qiáng)度為0.025u。

2,、器材

  載玻片,、打孔器、微量取液器,、稀釋板,、培養(yǎng)器或帶蓋培養(yǎng)皿。

操作方法

1,、抗體瓊脂板的制備

    將融化的瓊脂冷卻到55℃,，加入適量（看免疫血清的效價(jià)高低而定）的抗體，立即混勻（不要出現(xiàn)泡沫）,，將上述的抗體瓊脂（大約20mL）制成瓊脂板,，冷卻后打孔備用。

2,、加樣

   在各孔里加入不同稀釋度的抗原

3,、電泳

    在平板電泳槽里倒進(jìn)離子強(qiáng)度u=0.05的巴比妥緩沖液。將凝膠板平放在電泳槽中的隔板上,。瓊脂的兩端用浸溫的濾紙做橋與電泳槽的電極緩沖液相鏈接,，抗體端接正極。通電,，電流強(qiáng)度按瓊脂板的寬度計(jì)算（1～2mA/cm）,。觀察到白色沉淀線時(shí)，即電泳完畢（一般1h左右）,。一般通電后調(diào)電壓為10V/cm,，或電流強(qiáng)度為2～4mA/cm時(shí)間約1～5h。

4,、定量抗原

    在電泳一定時(shí)間后可以觀察到火箭狀的白色沉淀峰,。電泳完畢后可以用肉眼觀察量出已知抗原量的各個(gè)火箭的高度，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，便可測(cè)出未知濃度的抗原量,。如果計(jì)算的話，可用求積儀測(cè)定峰的面積,。

注意事項(xiàng)

1,、影響單向定量免電泳的因素很多，主要是要選擇好抗體濃度,，使抗原抗體濃度比例合適,。這就需要根據(jù)免疫血清的效價(jià)來(lái)定所加入瓊脂中的康體量，如效價(jià)高,，則免疫血清瓊脂的比列為1:5～9,，如效價(jià)低,，則免疫血清與瓊脂的比列為2:5。

2,、加入的抗體量要合適,，以保證抗原、抗體的合適比例,，以便形成清晰的沉淀峰,。抗體的準(zhǔn)確用量應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定,，即加入不同量的抗血清,，用一定量的抗原進(jìn)行火箭電泳，選出沉淀峰在2～5cm之間的相應(yīng)抗體濃度就是合適的抗體用量,。