氨基轉(zhuǎn)換作用

目的要求

1,、了解轉(zhuǎn)氨酶在代謝過(guò)程中的重要作用。

2,、學(xué)習(xí)應(yīng)用紙層析法鑒定氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng),。

實(shí)驗(yàn)原理

    體內(nèi)a-氨基酸的a-氨基在氨基轉(zhuǎn)換酶的作用下，移換至a-酮酸的過(guò)程,，稱氨基轉(zhuǎn)換作用,。此類酶各有一定的特異性，普遍存在于動(dòng)物各組織中,。

     本實(shí)驗(yàn)是將谷氨酸與丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)換酶的作用下進(jìn)行氨基轉(zhuǎn)化反應(yīng),，然后用紙層析法檢查反應(yīng)體系中丙氨酸的生成。

   由于谷氨酸,、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代謝途徑分解和轉(zhuǎn)化,，影響氨基轉(zhuǎn)換過(guò)程的觀察，因此在反應(yīng)體系中添加碘醋酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代謝過(guò)程,。

試劑和器材

1,、試劑

1%谷氨酸溶液,；1%丙酮酸鈉溶液；0.1%KHCO3溶液,；0.025%溴醋酸溶液,；2%Hac溶液；0.1%標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液,；0.1%標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液,；1%KOH溶液。

展開(kāi)劑,；酚飽和水溶液（2份酚加1份水混合放入分液漏斗,，振蕩。靜置24h后分層,，取下層酚置瓶中備用）,。

顯色劑：0.1%茚三酮正丁醇溶液。

2,、材料

肌肉糜：取兔子肌肉2g,，置研缽中，加0.9%氯化鈉溶液6mL,，在低溫下研磨成細(xì)漿,，離心5min，棄去沉淀,，得肌肉糜提取液,。

3、器材

試管1.5cm×15cm（×4）,；研缽,；毛細(xì)管；燒杯,；恒溫水?。慌囵B(yǎng)皿9cm（×2）,；直徑13cm圓形濾紙；噴霧器,；吹風(fēng)機(jī),。

操作方法

1、轉(zhuǎn)氨酶作用

（1）,、取試管2支編號(hào)（1,、2），向每個(gè)試管各加0.5mL谷氨酸溶液,，0.5mL  1%丙酮酸鈉溶液,，0.5mL 0.1%KHCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸,，混勻。然后分別加入肌肉糜提取液0.5mL,，混勻,，將其中一支試管立即在沸水浴中加熱2～3min做對(duì)照。用塞子塞住另一支試管,，置于45℃水浴中保溫60min,。

（2）、保溫完畢,，取出試管,。向每支試管中各加2%Hac溶液4滴，再置于沸水浴中2min,，使蛋白質(zhì)*沉淀,。過(guò)濾收集濾液代用。

2,、層析驗(yàn)證

（1）,、取培養(yǎng)皿一個(gè)，加入酚水飽和溶液,，約0.5cm高,。取圓形濾紙一張，在中心剪一直徑1～2mm的小孔,，并以圓心約1cm為半徑劃一圓作為底線,。在此底線上，用鉛筆點(diǎn)四個(gè)等距離的原點(diǎn)并表明1,2,3,4,。

（2）,、用毛細(xì)管分別吸取以上兩種濾液及標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸、丙氨酸,，依次點(diǎn)在標(biāo)明號(hào)碼的原點(diǎn)處,，以吹風(fēng)機(jī)吹干，再重新點(diǎn)樣2～4次,。注意斑點(diǎn)不能太大,，一般直徑約0.3cm為宜。然后將濾紙平放在盛飽和酚的培養(yǎng)皿上,。另取一條濾紙卷成筒狀,，直徑1～2nm，將此小筒插入濾紙中心小孔,，使層析濾紙通過(guò)此小筒與酚溶液相連,。另取一大小相同的培養(yǎng)皿蓋在濾紙上，此時(shí)酚溶液即由濾紙中心孔向四周擴(kuò)散。

（3）,、當(dāng)酚溶液擴(kuò)展到距離紙邊緣約1.5cm時(shí),，取出濾紙。用鉛筆化下酚溶液擴(kuò)展邊緣,，用吹風(fēng)機(jī)吹干,。用噴霧器噴以0.1%茚三酮溶液，再用熱風(fēng)吹干,。用鉛筆圈下各顯色點(diǎn),。測(cè)定各顯色點(diǎn)的Rf值，并解釋之,。

3,、計(jì)算公式

Rf=原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離