還原糖和總糖含量的測定

（3,5-二硝基水楊酸比色法）

一,、目的

掌握還原糖和總糖定量測定的基本原理，學(xué)習(xí)比色定糖法的基本操作,。

二,、原理

    還原糖和總糖含量的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類,，單糖都是還原糖,，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖,，蔗糖和淀粉是非還原糖,。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖,、雙糖和多糖分別提取出來,，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定,，在分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）,。

   還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕色紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸,。在一定范圍內(nèi),，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計,，在540nm波長下測定光吸收值,，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量,。由于多糖水解為單糖時,，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水，所以在計算多糖含量時應(yīng)乘以0.9,。

三,、實(shí)驗(yàn)用品

（一）、實(shí)驗(yàn)材料,。

面粉

（二）,、器皿

1、25mL刻度試管×11

2,、大塑料離心管×1

3,、100mL燒杯×1

4、100mL容量瓶×1

5,、移液管：1mL×2,2mL×2

6,、恒溫水浴鍋

7、沸水浴

8,、離心機(jī)

9,、電子天平

10、分光光度計

（三）,、試劑

1,、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重），置于小燒杯中,，用少量蒸餾水溶解后,，定量轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度,，搖勻,，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

2、3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,，在加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉,，攪拌至溶解。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL,，儲于棕色瓶中備用,。

四、操作步驟

（一）,、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取7支具有25mL刻度的刻度試管,，編號，加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑,。將各試管搖勻,，在沸水中加熱5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫,，再以蒸餾水定容到25mL刻度處,，用橡皮塞塞住試管口,，顛倒混勻。在540nm波長下,，用0號試管調(diào)零,，分別讀取1～6試管的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo),，葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（二）,、樣品中還原糖含量的測定

1,、樣品中還原糖的提取

    準(zhǔn)確稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中,，先以少量蒸餾水?dāng)噭?，置?0℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出,。然后轉(zhuǎn)入大塑料離心管中,，4000r/min離心5min，上清液全部收集到100mL的容量瓶中,，用蒸餾水定容至刻度,，混勻，作為還原糖待測液,。

2,、總糖的水解和提取

    準(zhǔn)確稱取1g食用面粉，放入100mL三角瓶中,，加15mL蒸餾水及10mL6mol/L HCI,，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否*可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后,，加入1滴酚酞指示劑,，用6mol/L，NaOH中和至微紅色,，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中,，混勻。將定容后的水解液過濾,，取濾液10mL,，移入另一100mL容量瓶中定容，混勻,，作為總糖待測液,。

3、顯色和比色

    取4支25mL刻度試管，編號,。分別加入待測夜和顯色劑,，空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號試管。加熱,、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同,。

五、附注

1,、離心比過濾易得上清液

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時進(jìn)行,，一起顯色和比色,。