還原糖和總糖含量的測定

（3,5-二硝基水楊酸比色法）

一,、目的

掌握還原糖和總糖定量測定的基本原理，學(xué)習(xí)比色定糖法的基本操作,。

二,、原理

    還原糖和總糖含量的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖,，雙糖和多糖不一定是還原糖,，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖,。利用糖的溶解度不同,，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來,，對沒有還原性的雙糖和多糖,，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，在分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）,。

   還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物,，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕色紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi),，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系,，利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光吸收值,，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算,，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時,，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子水,，所以在計(jì)算多糖含量時應(yīng)乘以0.9。

三,、實(shí)驗(yàn)用品

（一）,、實(shí)驗(yàn)材料。

面粉

（二）,、器皿

1,、25mL刻度試管×11

2、大塑料離心管×1

3,、100mL燒杯×1

4,、100mL容量瓶×1

5、移液管：1mL×2,2mL×2

6,、恒溫水浴鍋

7,、沸水浴

8、離心機(jī)

9,、電子天平

10,、分光光度計(jì)

（三）、試劑

1,、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取100mg分析純葡萄糖（預(yù)先在80℃烘至恒重）,，置于小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中,，以蒸餾水定容至刻度,，搖勻，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

2,、3,5-二硝基水楊酸試劑：將6.3 g 3,5-二硝基水楊酸和262mL 2mol/L NaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中,，在加5g結(jié)晶苯酚和5g亞硫酸鈉，攪拌至溶解,。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL,，儲于棕色瓶中備用。

四,、操作步驟

（一）,、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

    取7支具有25mL刻度的刻度試管，編號,，加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和3,5-二硝基水楊酸試劑,。將各試管搖勻，在沸水中加熱5min,，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫,，再以蒸餾水定容到25mL刻度處，用橡皮塞塞住試管口,，顛倒混勻,。在540nm波長下，用0號試管調(diào)零,，分別讀取1～6試管的吸光值,。以吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

（二）、樣品中還原糖含量的測定

1,、樣品中還原糖的提取

    準(zhǔn)確稱取3g食用面粉，放在100mL的燒杯中,，先以少量蒸餾水?dāng)噭?，置?0℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出,。然后轉(zhuǎn)入大塑料離心管中,，4000r/min離心5min，上清液全部收集到100mL的容量瓶中,，用蒸餾水定容至刻度,，混勻，作為還原糖待測液。

2,、總糖的水解和提取

    準(zhǔn)確稱取1g食用面粉,，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL6mol/L HCI,，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否*可用碘-碘化鉀溶液檢查）,。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑,，用6mol/L,，NaOH中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中,，混勻,。將定容后的水解液過濾，取濾液10mL,，移入另一100mL容量瓶中定容,，混勻，作為總糖待測液,。

3,、顯色和比色

    取4支25mL刻度試管，編號,。分別加入待測夜和顯色劑,，空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號試管。加熱,、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同,。

五、附注

1,、離心比過濾易得上清液

2,、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品含糖量測定應(yīng)同時進(jìn)行，一起顯色和比色,。