影響酶促反應的因素—溫度,、PH和抑制劑

目的要求

 通過本實驗了解pH、溫度,、抑制劑對酶活力的影響,。

實驗原理

 酶作為生物催化劑與一般催化劑一樣呈現(xiàn)溫度效應,。酶促反應開始時，反應速度隨溫度升高增快,。達到zui大反應速度時的溫度稱為某種酶的zui適溫度,。由于絕大多數(shù)酶是有活性的蛋白質(zhì)，當達到zui適溫度后,，繼續(xù)升高溫度,，引起蛋白質(zhì)變性，酶促反應速度反而逐步下降,，以致*停止,。

    酶的zui適溫度不是一個常熟,，與作用時間長短有關,。測定酶活性均在酶促反應zui適溫度下進行。大多數(shù)動物來源的酶zui適溫度為37～40℃,，植物來源的酶zui適溫度為50～60℃,。

    酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關系，通常各種酶只在一定pH范圍內(nèi)才具有活性,，酶活性zui高時的pH,，稱為酶的zui適pH。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低,。

   酶的zui適pH不是一個特征物理常數(shù),，對于同一個酶，其zui適pH因緩沖液和底物的性質(zhì)不同而又差異,。

   在酶促反應過程中,，抑制劑對酶的抑制作用可分為可逆抑制和不可逆抑制?？赡嬉种朴懈鶕?jù)抑制劑和底物的關系分為三種類型：競爭性抑制,、非競爭性抑制和反競爭性抑制。

   在本試驗中,，胰蛋白酶的zui適溫度為37℃,，zui適pH值為8.1.胰蛋白酶的抑制劑為苯甲脒，其抑制方式為競爭性抑制,。

試劑和器材

1,、試劑

5%三氯醋酸溶液。1mmol/L苯甲脒溶液：稱取19.25g苯甲脒,，用少量水溶解,，定容至100mL。

1%酪蛋白溶液：取1g酪蛋白,，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL,、水40mL,，置60℃水浴加熱至溶解，放置室溫后,，加水稀釋成100mL,，并調(diào)至pH8.0.

0.1mol/L硼酸緩沖液：

A液，0.1mol/L硼酸（H3BO3）：稱取6.18gH3BO3溶于1000mL水中,。

B液,，0.025mol/L硼砂（Na2B4O7·10H2O）：

稱取9.54g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶于1000mL水中。

pH7.4硼酸緩沖液：90mL A液+10mL B液

pH8.0硼酸緩沖液：70mL A液+30mL B液

pH9.0硼酸緩沖液：20mL A液+80mL B液

2,、材料

胰蛋白酶溶液：50～200ug/mL,，用0.1mol/L，pH8.0硼酸緩沖液配制,?？捎么痔岬呢i胰蛋白酶，用量根據(jù)實際測的比活值而定,。

3,、儀器

試管1.5cm×15cm（×19）；移液管1mL（×7）,，2mL（×3）,，5mL（×5）；量筒100mL（×1）,，恒溫水?。凰?0(0℃）,；白瓷板,；膠頭滴管。

操作方法

1,、溫度對酶活力的影響

取3支試管,，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后,，再加入0.2mL酶液,，0.8mL蒸餾水，在37℃保溫10min,。

將樣品管和空白管分別離心,，3000r/min，5分鐘,，取上清液于280nm處測定各管的吸光值,，并比較之。

2,、pH對酶活力的影響

取3支試管,，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,，搖勻后，再加入0.2mL酶液,，0.8蒸餾水,，在37℃保溫10min。

 將樣品管和空白管分別離心,，3000r/min,，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值,，并比較之,。

3、抑制劑對酶活力的影響

取3支試管,，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,，搖勻后，再加入0.2mL酶液,，0.8蒸餾水,，在37℃保溫10min,。

將樣品管和空白管分別離心,，3000r/min，5分鐘,，取上清液于280nm處測定各管的吸光值,。并比較之。

注意事項

1,、由于胰蛋白酶活力不同,，因此實驗應隨時檢查反應進行情況。如反應進行的太快,，應適當稀釋酶液,；反之，則應減少酶溶液的稀釋倍數(shù),。

2,、注意不要在檢查反應程度時使各管溶液混雜。