影響酶促反應(yīng)的因素—溫度,、PH和抑制劑

目的要求

 通過本實驗了解pH、溫度,、抑制劑對酶活力的影響。

實驗原理

 酶作為生物催化劑與一般催化劑一樣呈現(xiàn)溫度效應(yīng),。酶促反應(yīng)開始時,，反應(yīng)速度隨溫度升高增快。達到zui大反應(yīng)速度時的溫度稱為某種酶的zui適溫度,。由于絕大多數(shù)酶是有活性的蛋白質(zhì)，當(dāng)達到zui適溫度后,，繼續(xù)升高溫度,，引起蛋白質(zhì)變性，酶促反應(yīng)速度反而逐步下降,，以致*停止。

    酶的zui適溫度不是一個常熟,，與作用時間長短有關(guān),。測定酶活性均在酶促反應(yīng)zui適溫度下進行,。大多數(shù)動物來源的酶zui適溫度為37～40℃，植物來源的酶zui適溫度為50～60℃,。

    酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關(guān)系,，通常各種酶只在一定pH范圍內(nèi)才具有活性，酶活性zui高時的pH,，稱為酶的zui適pH,。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低,。

   酶的zui適pH不是一個特征物理常數(shù),，對于同一個酶，其zui適pH因緩沖液和底物的性質(zhì)不同而又差異,。

   在酶促反應(yīng)過程中，抑制劑對酶的抑制作用可分為可逆抑制和不可逆抑制,?？赡嬉种朴懈鶕?jù)抑制劑和底物的關(guān)系分為三種類型：競爭性抑制,、非競爭性抑制和反競爭性抑制,。

   在本試驗中，胰蛋白酶的zui適溫度為37℃,，zui適pH值為8.1.胰蛋白酶的抑制劑為苯甲脒，其抑制方式為競爭性抑制,。

試劑和器材

1,、試劑

5%三氯醋酸溶液,。1mmol/L苯甲脒溶液：稱取19.25g苯甲脒，用少量水溶解,，定容至100mL,。

1%酪蛋白溶液：取1g酪蛋白,，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL、水40mL,，置60℃水浴加熱至溶解,，放置室溫后,，加水稀釋成100mL，并調(diào)至pH8.0.

0.1mol/L硼酸緩沖液：

A液,，0.1mol/L硼酸（H3BO3）：稱取6.18gH3BO3溶于1000mL水中,。

B液,，0.025mol/L硼砂（Na2B4O7·10H2O）：

稱取9.54g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶于1000mL水中。

pH7.4硼酸緩沖液：90mL A液+10mL B液

pH8.0硼酸緩沖液：70mL A液+30mL B液

pH9.0硼酸緩沖液：20mL A液+80mL B液

2,、材料

胰蛋白酶溶液：50～200ug/mL,，用0.1mol/L，pH8.0硼酸緩沖液配制,?？捎么痔岬呢i胰蛋白酶,，用量根據(jù)實際測的比活值而定。

3,、儀器

試管1.5cm×15cm（×19）,；移液管1mL（×7）,，2mL（×3），5mL（×5）,；量筒100mL（×1）,，恒溫水浴,；水浴90(0℃）,；白瓷板；膠頭滴管,。

操作方法

1、溫度對酶活力的影響

取3支試管,，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,，搖勻后,，再加入0.2mL酶液，0.8mL蒸餾水,，在37℃保溫10min,。

將樣品管和空白管分別離心,，3000r/min，5分鐘,，取上清液于280nm處測定各管的吸光值,，并比較之,。

2,、pH對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液,，搖勻后,，再加入0.2mL酶液,，0.8蒸餾水，在37℃保溫10min,。

 將樣品管和空白管分別離心,，3000r/min,，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值,，并比較之,。

3,、抑制劑對酶活力的影響

取3支試管,，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后,，再加入0.2mL酶液,，0.8蒸餾水，在37℃保溫10min,。

將樣品管和空白管分別離心,，3000r/min，5分鐘,，取上清液于280nm處測定各管的吸光值,。并比較之。

注意事項

1,、由于胰蛋白酶活力不同，因此實驗應(yīng)隨時檢查反應(yīng)進行情況,。如反應(yīng)進行的太快,，應(yīng)適當(dāng)稀釋酶液；反之,，則應(yīng)減少酶溶液的稀釋倍數(shù),。

2,、注意不要在檢查反應(yīng)程度時使各管溶液混雜。