細胞傳代培養(yǎng)的流程和注意事項如下:
1,、當(dāng)細胞密度達到其生長密度高處時(一般腫瘤細胞為80-100%,原代細胞和干細胞為80-90%,,有些細胞為40-50%,,熟知所養(yǎng)細胞的生長密度極限),移除舊培養(yǎng)液,;
2,、用PBS洗滌兩次(舊培養(yǎng)中的鈣離子會抑制胰酶的活性),,加入1ml胰酶消化液(以T25培養(yǎng)瓶為例),立即蓋好蓋子,,把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察,,如大部分細胞變圓,立即移除胰酶消化液(如大部分細胞漂起,,可不移除胰酶消化液),,加入5ml預(yù)熱培養(yǎng)基,用吸管取培養(yǎng)液吹打瓶壁細胞,,使其脫離瓶壁形成單細胞懸液,,離心,小心移除上清,;
3,、加入5ml預(yù)熱培養(yǎng)基,吹打重懸細胞用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計算細胞數(shù),,分裝入T25培養(yǎng)瓶中,,添加基至總體積為5ml,置于37℃,、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),;傳代1次。
注意事項:
1.熟知所養(yǎng)細胞的生長密度高處,;
2.第一次進行所養(yǎng)細胞傳代時,,消化時必須把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察,并記錄所需時間,,下次按照該時間執(zhí)行即可;
3.進行細胞傳代時必須結(jié)合考慮細胞生長密度需求(啟動正常生長所需的密度)和實際的工作需求,,在滿足細胞生長密度需求的前提下,,需要多少瓶就傳多少瓶,降低工作強度和試劑耗材消耗,;
4.離心速度和時間依據(jù)具體細胞決定,。
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