TUNEL法檢測細胞凋亡原理和經(jīng)驗
細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端,，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶,、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測,，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法,。
由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成,，很少能夠被染色,。由此，TUNEL成為了檢測DNA片段化（細胞凋亡）的方法,。
TUNEL檢測：使用10 U/ml Dnase處理Hela細胞10分鐘
關(guān)鍵步驟:
1.充分脫蠟和水化
脫蠟可以先 60oC20 min,，再用使用二甲苯兩次 5-10min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,，這些以便后面的結(jié)合反應充分,、均勻；
2. 把握好細胞通透的時間,。
一般根據(jù)切片的厚薄,，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30min,，幾 μm 切片用短時間,；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達到既不脫片,，有能夠使后面的酶和抗體進入胞內(nèi),。
3. 適當延長 TUNEL 反應液的時間。
一般是37oC 二氧化碳培養(yǎng)箱1h,，也可以根據(jù)凋亡損傷程度,，選擇更長的時間，可長至 2h,，但要結(jié)合最終的背景著色,。
4. DAB 顯色條件的選擇,。
一般 DAB 反應10 min左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色,，最長不超過 30min,。
5. PBS 的充分清洗。
在 TUNEL 反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格,，可增加次數(shù)達 5次，因為這些清洗直接決定最后切片的非特異性著色,。
6. 此外,，內(nèi)源性 POD 的封閉也十分關(guān)鍵。
對于肝臟,、腎臟等血細胞含量多的組織,，適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果,，且不影響最終的特異性染色,。
細胞通透的時間選擇
1.蛋白酶 k 的目的是通透細胞膜和核膜，從而使反應試劑充分進入細胞核進行反應,，提高陽性率,。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片，只要不脫片,，影響不大,，其作用類似與 TritonX100 等細胞通透劑。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10mg/ml,，可用 PBS 配制,，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份,，用完一支再用下一支,，-20oC保存 1 個月應該沒問題的（重復拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上,。
3. 蛋白酶K反應時間一般為10-30min,，具體時間長短與切片厚薄有關(guān)，4μm左右的片子可以用10min,，但30μm左右的可用30 min,，最終通過摸索最佳時間。過長易脫片,、過短起不到通透效果,。
關(guān)鍵試劑操作條件：DAB 顯色反應大約需要10min，要控制好反應時間,，勿使背景顏色過深,。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度,、試劑盒種類不同來摸索一下；蛋白酶K工作液處理時間,、溫度須在范圍內(nèi)摸索,，溫度過高，時間過長,，易破壞核酸結(jié)構(gòu),，出現(xiàn)假陽性；DNase1一般室溫,，10min即可,。
如何減弱非特異性染色
若是肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過氧化物酶,，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間,。其他還可以加強滅活、縮短 DAB 孵育時間,、PBS 充分清洗,，注意鏡下把握好著色。
Tips:
1.濕盒用帶蓋方盤,，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片,，使用時稍加水即可。
2.英文說明書中對組織細胞通透這一步中,，加了“對難處理的組織的處理",，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后，應該陽性而做不出陽性時,，可用微波修復,。
3.復染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，以利于結(jié)果分析,，石蠟切片常用蘇木素,，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠,，核染成綠色,。
4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4,、KH2PO4配制,，加蒸餾水稀釋后即可用。
5.蛋白酶 K 消化蛋白后,，需要用封閉液,。
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