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TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡原理和經(jīng)驗
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下,，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端,，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法。
由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂,，因而沒有3'-OH形成,，很少能夠被染色。由此,，TUNEL成為了檢測DNA片段化（細(xì)胞凋亡）的方法,。
TUNEL檢測：使用10 U/ml Dnase處理Hela細(xì)胞10分鐘
關(guān)鍵步驟:
1.充分脫蠟和水化
脫蠟可以先 60oC20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10min,；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗,，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻,；
2. 把握好細(xì)胞通透的時間,。
一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間,，常用 10-30min,，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間,，通過摸索達(dá)到既不脫片,，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。
3. 適當(dāng)延長 TUNEL 反應(yīng)液的時間,。
一般是37oC 二氧化碳培養(yǎng)箱1h,，也可以根據(jù)凋亡損傷程度，選擇更長的時間,，可長至 2h,，但要結(jié)合最終的背景著色。
4. DAB 顯色條件的選擇。
一般 DAB 反應(yīng)10 min左右,，結(jié)合鏡下控制背景顏色,，最長不超過 30min。
5. PBS 的充分清洗,。
在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格,，可增加次數(shù)達(dá) 5次，因為這些清洗直接決定最后切片的非特異性著色,。
6. 此外,，內(nèi)源性 POD 的封閉也十分關(guān)鍵。
對于肝臟,、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織,，適當(dāng)延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達(dá)到很好的封閉效果,，且不影響最終的特異性染色,。
細(xì)胞通透的時間選擇
1.蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜，從而使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng),，提高陽性率,。但濃度過高或孵育時間太長容易脫片，只要不脫片,，影響不大,，其作用類似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10mg/ml,，可用 PBS 配制,，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份,，用完一支再用下一支,，-20oC保存 1 個月應(yīng)該沒問題的（重復(fù)拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上,。
3. 蛋白酶K反應(yīng)時間一般為10-30min,，具體時間長短與切片厚薄有關(guān)，4μm左右的片子可以用10min,，但30μm左右的可用30 min,，最終通過摸索最佳時間。過長易脫片,、過短起不到通透效果,。
關(guān)鍵試劑操作條件：DAB 顯色反應(yīng)大約需要10min,，要控制好反應(yīng)時間,，勿使背景顏色過深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來源和切片厚度,、試劑盒種類不同來摸索一下,；蛋白酶K工作液處理時間,、溫度須在范圍內(nèi)摸索，溫度過高,，時間過長,，易破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽性,；DNase1一般室溫,，10min即可。
如何減弱非特異性染色
若是肝臟或腎臟,，因富含內(nèi)源性過氧化物酶,，需要增加過氧化氫濃度和延長孵育時間。其他還可以加強(qiáng)滅活,、縮短 DAB 孵育時間,、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著色,。
Tips:
1.濕盒用帶蓋方盤,，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時稍加水即可,。
2.英文說明書中對組織細(xì)胞通透這一步中,，加了“對難處理的組織的處理"，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后,，應(yīng)該陽性而做不出陽性時,，可用微波修復(fù)。
3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu),，以利于結(jié)果分析,，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色,，冷凍切片常用甲基綠,，核染成綠色。
4.PBS 用蒸餾水,、Na2HPO4,、KH2PO4配制，加蒸餾水稀釋后即可用,。
5.蛋白酶 K 消化蛋白后,，需要用封閉液。