在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗中,，細(xì)胞生長在上層含有細(xì)胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中,，下層軟瓊脂也與細(xì)胞培養(yǎng)基混合，但含有較高濃度的瓊脂,。這可以防止細(xì)胞貼附在培養(yǎng)板上,，還可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成可見的菌落,。這種技術(shù)的原理是正常細(xì)胞依靠細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸才能生長和分裂，相反,，不管周圍環(huán)境如何,，轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有生長和分化的能力，因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細(xì)胞被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化和致癌的,。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關(guān)實驗的方法,，這種方法的總體目標(biāo)是以半定量和嚴(yán)格的方式測定細(xì)胞的這種能力。
實驗操作：
準(zhǔn)備材料和試劑：
1,、配制2×培養(yǎng)基：1 g培養(yǎng)基粉末,，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水,，定容到50 mL,。
2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌,。
3,、加入目標(biāo)細(xì)胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細(xì)胞需要加入10% FBS,，1% 青霉素/鏈霉素,。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C水浴鍋中。
4,、配制1×培養(yǎng)基,，依照目標(biāo)細(xì)胞生長所需培養(yǎng)基配制。
5,、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中,。
6、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中,。
7,、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌，滅菌后可放在4°C保存,，使用前加熱至*溶解,。
8、配制氯化硝基四氮唑藍(lán)試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍(lán)加入到1×PBS中,。
鋪下膠：
1,、將熔化的1%瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或水浴鍋）中，在熱水里放一個50 mL的錐形管,。將桶放入超凈臺內(nèi),。
2、6孔板中的每個孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基,，為保證足夠的量,，一個6孔板準(zhǔn)備12 mL,。
3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管,，再加入6 mL的1%瓊脂溶液,。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻，每個孔中迅速加入1.5 mL混合液,，加混合液時不能產(chǎn)生氣泡,。
4、室溫靜置30 min,，待下膠凝固,。
鋪上膠：
1、收獲的細(xì)胞用胰蛋白酶消化,，用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶,，加4 mL培養(yǎng)基），放入15 mL錐形管,。
2,、細(xì)胞計數(shù)：以每孔5000個細(xì)胞作為起始，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整,。
3,、細(xì)胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個6孔板準(zhǔn)備12 mL細(xì)胞懸液,。
4,、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中，在熱水里放一個50 mL的錐形管,。將桶放入超凈臺內(nèi)。
5,、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細(xì)胞懸液,，吸取6 mL細(xì)胞懸浮液到50 mL錐形管，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液,?；靹蚝笱杆偌尤?孔板中，每孔1.5 ml,。小心避免產(chǎn)生氣泡,。
6、室溫靜置30 min,，待上膠凝固后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱,。
7、足夠的菌落形成所需的時間因每個細(xì)胞系而異,，通常為21天左右,。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥,。
以上內(nèi)容僅供參考，詳情請咨詢上海喆圖,。
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