在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗中，細胞生長在上層含有細胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中,，下層軟瓊脂也與細胞培養(yǎng)基混合,，但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細胞貼附在培養(yǎng)板上,，還可以使轉(zhuǎn)化細胞形成可見的菌落,。這種技術(shù)的原理是正常細胞依靠細胞與細胞外基質(zhì)的接觸才能生長和分裂，相反,，不管周圍環(huán)境如何,，轉(zhuǎn)化細胞均具有生長和分化的能力，因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細胞被認為是轉(zhuǎn)化和致癌的,。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關(guān)實驗的方法,，這種方法的總體目標(biāo)是以半定量和嚴格的方式測定細胞的這種能力。
實驗操作：
準備材料和試劑：
1,、配制2×培養(yǎng)基：1 g培養(yǎng)基粉末,，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水,，定容到50 mL,。
2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌,。
3,、加入目標(biāo)細胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細胞需要加入10% FBS,，1% 青霉素/鏈霉素,。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C水浴鍋中,。
4、配制1×培養(yǎng)基,，依照目標(biāo)細胞生長所需培養(yǎng)基配制,。
5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中,。
6,、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。
7,、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌,，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至*溶解,。
8,、配制氯化硝基四氮唑藍試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍加入到1×PBS中。
鋪下膠：
1,、將熔化的1%瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或水浴鍋）中,，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi),。
2,、6孔板中的每個孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基，為保證足夠的量,，一個6孔板準備12 mL,。
3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管,，再加入6 mL的1%瓊脂溶液,。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻，每個孔中迅速加入1.5 mL混合液,，加混合液時不能產(chǎn)生氣泡,。
4、室溫靜置30 min,，待下膠凝固,。
鋪上膠：
1、收獲的細胞用胰蛋白酶消化,，用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶,，加4 mL培養(yǎng)基），放入15 mL錐形管,。
2,、細胞計數(shù)：以每孔5000個細胞作為起始，并根據(jù)需要進行調(diào)整。
3,、細胞懸浮液的體積需要1.5 mL,。一個6孔板準備12 mL細胞懸液。
4,、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中,，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi),。
5,、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細胞懸液，吸取6 mL細胞懸浮液到50 mL錐形管,，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液?；靹蚝笱杆偌尤?孔板中,，每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡,。
6,、室溫靜置30 min，待上膠凝固后放入細胞培養(yǎng)箱,。
7,、足夠的菌落形成所需的時間因每個細胞系而異，通常為21天左右,。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥,。
以上內(nèi)容僅供參考，詳情請咨詢上海喆圖,。
(空格分隔,最多3個,單個標(biāo)簽最多10個字符)
20
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)