在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中,，細(xì)胞生長(zhǎng)在上層含有細(xì)胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中，下層軟瓊脂也與細(xì)胞培養(yǎng)基混合,，但含有較高濃度的瓊脂,。這可以防止細(xì)胞貼附在培養(yǎng)板上，還可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞形成可見(jiàn)的菌落,。這種技術(shù)的原理是正常細(xì)胞依靠細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸才能生長(zhǎng)和分裂,，相反，不管周圍環(huán)境如何,，轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有生長(zhǎng)和分化的能力,，因此能夠以錨定獨(dú)立的方式形成菌落的細(xì)胞被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化和致癌的。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關(guān)實(shí)驗(yàn)的方法,，這種方法的總體目標(biāo)是以半定量和嚴(yán)格的方式測(cè)定細(xì)胞的這種能力,。
實(shí)驗(yàn)操作：
準(zhǔn)備材料和試劑：
1,、配制2×培養(yǎng)基：1 g培養(yǎng)基粉末,，0.2 g碳酸氫鈉,，加入去離子水，定容到50 mL,。
2,、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌。
3,、加入目標(biāo)細(xì)胞所需培養(yǎng)基的其他成分,。例如：用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細(xì)胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/鏈霉素,。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C水浴鍋中,。
4、配制1×培養(yǎng)基,，依照目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基配制,。
5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中,。
6,、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。
7,、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌,，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至*溶解,。
8,、配制氯化硝基四氮唑藍(lán)試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍(lán)加入到1×PBS中。
鋪下膠：
1,、將熔化的1%瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或水浴鍋）中,，在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺(tái)內(nèi),。
2,、6孔板中的每個(gè)孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基，為保證足夠的量,，一個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 mL,。
3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管,，再加入6 mL的1%瓊脂溶液,。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻，每個(gè)孔中迅速加入1.5 mL混合液,，加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡,。
4、室溫靜置30 min，待下膠凝固,。
鋪上膠：
1,、收獲的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶,，加4 mL培養(yǎng)基）,，放入15 mL錐形管。
2,、細(xì)胞計(jì)數(shù)：以每孔5000個(gè)細(xì)胞作為起始,，并根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
3,、細(xì)胞懸浮液的體積需要1.5 mL,。一個(gè)6孔板準(zhǔn)備12 mL細(xì)胞懸液。
4,、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中,，在熱水里放一個(gè)50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺(tái)內(nèi),。
5,、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細(xì)胞懸液，吸取6 mL細(xì)胞懸浮液到50 mL錐形管,，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液,。混勻后迅速加入6孔板中,，每孔1.5 ml,。小心避免產(chǎn)生氣泡。
6,、室溫靜置30 min,，待上膠凝固后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。
7,、足夠的菌落形成所需的時(shí)間因每個(gè)細(xì)胞系而異,，通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥,。
以上內(nèi)容僅供參考,，詳情請(qǐng)咨詢上海喆圖。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
會(huì)員.png)
20
立即詢價(jià)
您提交后,，專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)