厭氧菌需有較低的氧化—還原勢(shì)能才能生長(zhǎng)(例如破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌需氧化—還原電勢(shì)降低至0.11V時(shí)才開(kāi)始生長(zhǎng))，在有氧的環(huán)境下,，培養(yǎng)基的氧化—還原電勢(shì)較高,，不適于厭氧菌的生長(zhǎng)。為使培養(yǎng)基降低勢(shì),，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的?，F(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多，主要有生物學(xué),，化學(xué)和物理學(xué)3種方法,，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用,。
1．生物學(xué)方法
培養(yǎng)基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥,、發(fā)芽谷物等)或動(dòng)物組織(新鮮無(wú)菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉,、心、腦等),，由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而消耗氧氣(如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣,，碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用，就是根據(jù)這個(gè)原理),，組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—還原電勢(shì)下降,。
另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個(gè)平皿內(nèi),，利用需氧菌的生長(zhǎng)將氧消耗后,，使厭氧菌能生長(zhǎng)。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌(如枯草桿菌),，另一半接種厭氧菌,，接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封,，置37恒溫箱中培養(yǎng)2~3d后,，即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(zhǎng)。
2．化學(xué)方法
利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收,，或用還原氧化型物質(zhì)，降低氧化—還原電勢(shì),。
李伏夫(B．M．JIbbob)法
此法系用連二亞硫酸納(Sodium hydrosulphite)和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣,，其反應(yīng)式如下：
Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02
取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花,，將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)(如系液體培養(yǎng)基,，則直立于罐內(nèi))，*上端保留可容納1~2個(gè)平皿的空間(視玻罐的體積而定),，按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g,，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中,，加水少許使混合物潮濕,，但不可過(guò)濕，以免罐內(nèi)水分過(guò)多,。若用無(wú)蓋玻罐，則可將平皿重疊正放在淺底容器上,，以無(wú)蓋玻罐罩于皿上,，罐口周圍用膠泥或水銀封閉,。
焦性沒(méi)食子酸法 焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣，同時(shí)由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻](méi)食臍(Purpurgallin),。每l00cm3空間用焦性沒(méi)食子酸1g及10％氫氧化納或氫氧化鉀l0ml,，其具體方法主要有下列幾種：
（1）單個(gè)培養(yǎng)皿法：將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊,，中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片,，在其上放焦性沒(méi)食子酸0.2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋,，將培養(yǎng)皿倒置于其上,，周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放人37C溫箱培養(yǎng)24~48h后,，取出觀察,。
（2）Buchner氏試管法：取一大試管，在管底放焦性沒(méi)食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個(gè)或放一螺旋狀鉛絲,。將已接種的培養(yǎng)管放人大試管中,，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即將管口用橡皮塞塞緊,，必要時(shí)周圍封以石蠟,，37培養(yǎng)24~48h后觀察。
（3）玻罐或干燥器法：置適量焦性沒(méi)食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面,，將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上,，并在玻罐內(nèi)置美藍(lán)指示劑一管，從罐側(cè)加入氫氧化鈉溶液放于罐底,，將焦性沒(méi)食子酸用紙或紗布包好,，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸,，待一切準(zhǔn)備好后．將線放下,，使焦性沒(méi)食子酸落人氫 氧化納溶液中，立即將蓋蓋好,；封緊,，置溫箱中培養(yǎng)。
（4）瑞(Wright)氏法：將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后,，塞人管中離培養(yǎng)基1~1．5cm處,，置適量焦性沒(méi)食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml,，迅速用橡皮塞將管口塞緊,，以膠泥或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng)。
（5）史(Spray)氏法：用厭氧培養(yǎng)皿，在皿底一邊置焦性沒(méi)食子酸,，另一邊置氫氧化鈉溶液,，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封*,，然后搖動(dòng)底部,，使氫氧化鈉溶液與焦性沒(méi)食子酸混合，置溫箱中培養(yǎng),。
（6）平皿法：置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間,，上面的平皿接種細(xì)菌，下面的平皿盛焦性沒(méi)食子酸及氫氧化鈉溶液,，用膠泥封固后,，置溫箱中培養(yǎng)。
（7）硫乙醇酸鈉法 硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑,，加入培養(yǎng)基中,，能除去其中的氧或還原性物質(zhì)，促使厭氧菌生長(zhǎng),。其他可用的還原劑包括葡萄糖,、維生素C、半胱氨酸等,。 A．液體培養(yǎng)基法：將細(xì)菌種人含0.1％的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中,，37℃培養(yǎng)24~48h后觀察，本培養(yǎng)基中加美藍(lán)液作為氧化還原的指示劑,，在無(wú)氧條件下,，美藍(lán)被還原成無(wú)色。
Ｂ．固體培養(yǎng)基法：常采用特殊構(gòu)造的Brewer培養(yǎng)皿,，可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)而形成孤立的菌落,；操作過(guò)程是先將Brewer氏皿干熱滅菌，將溶化且冷卻至50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾人皿內(nèi),。待瓊脂冷凝后,，將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分,。蓋上皿蓋,，使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸。此時(shí)皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原,，故美藍(lán)應(yīng)逐漸褪色,，而外緣部分，因與大氣相通,，故仍呈藍(lán)色,。將Brewer氏培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內(nèi),，經(jīng)過(guò)24~48h后觀察。
3．物理學(xué)方法
利用加熱,、密封,、抽氣等物理學(xué)方法,，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣,，使其形成厭氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育,。
（1）厭氧罐法 :
常用的厭氧罐有Brewer氏罐,，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐）。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中,，先抽去部分空氣,，代以氫氣至大氣壓。通電,，使罐中殘存的氧與氫經(jīng)鉑或鈀的催化而化合成水,，使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放人孵育箱培養(yǎng),。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng),。
（２）真空干燥器法 :
將欲培養(yǎng)的平皿或試管放人真空干燥器中，開(kāi)動(dòng)抽氣機(jī),，抽至高度真空后,，替代以氫、氮或二氧化碳?xì)怏w,。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱培養(yǎng),。
（３）高層瓊脂法:
加熱融化高層瓊脂，冷至45℃左右接種厭氧菌,，迅速混合均勻,。冷凝后37℃培養(yǎng)，厭氧菌在近管底處生長(zhǎng),。
（４）加熱密封法:
將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內(nèi)加熱l0min,，驅(qū)除溶解于液體中的空氣，取出,，迅速置于冷水中冷卻,。接種厭氧菌后，在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約0.5cm的無(wú)菌凡士林石蠟,，置37℃培養(yǎng),。此外，尚有搖振培養(yǎng)法,，此處從略,。
（５）二氧化碳培養(yǎng)法:
少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌(牛型)等，孵育時(shí)，需大氣中添加5％~10％二氧化碳,，方能使之生長(zhǎng)繁殖旺盛,。常用的方法是置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；*簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法是在盛放培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi),，燃點(diǎn)蠟燭,，當(dāng)火焰熄滅時(shí)，該缸的大氣中,，就約增加了5％~10％的二氧化碳,。也可用化學(xué)物質(zhì)作用后生成二氧化碳，如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳,。若各用0.4％NaHCO3與30％H2SO4lmL,，則可產(chǎn)生22.4mL的二氧化碳?xì)怏w。
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