今天喆圖小編就來(lái)說(shuō)說(shuō)利用蛋白質(zhì)分離純化方法,，從枯草芽孢桿菌中分離出纖維素酶，將其分別作用于羧甲基纖維素（CMC）和濾紙,，其生成的還原性糖能和3.5--二硝基水楊酸（DNS）反應(yīng)生成棕紅色物質(zhì)，利用分光光度法測(cè)出纖維素酶的活性強(qiáng)度,。
纖維素酶
濾紙?zhí)?strong> ———— 纖維二糖,、葡萄糖等還原性糖 +DNS ———— 棕紅色物質(zhì)
所需藥品材料：氫氧化鈉、葡萄糖,、3.5--二硝基水楊酸（DNS）,、硝酸、冰醋酸,、醋酸鈉,、酒石酸、濾紙,、纖維素酶制劑,。
試驗(yàn)需用儀器：分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋,、鼓風(fēng)干燥箱,、分析天平
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
一、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備工作:
1,、醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制：量取冰醋酸6ml,，定容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸溶液,。 稱取8.2g醋酸鈉,，溶解后容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸鈉溶液,。使用時(shí)以4：6的比例混合,，放入低溫保存箱中冷藏備用。
2,、葡萄糖溶液的配制：將葡萄糖在鼓風(fēng)干燥箱中105℃下干燥至恒重,，準(zhǔn)確稱取100mg 于100mL 小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后,，移入100mL 容量瓶中用蒸餾水定容至100mL,，充分混勻。
3,、3.5--二硝基水楊酸的配制：準(zhǔn)確稱取DNS 6.3g于500mL 大燒杯中,，用少量蒸餾水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL,，再加到500mL 含有185g 酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa · 4H2O,，MW=282.22）的熱水溶液中,，再加5g結(jié)晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g無(wú)水亞硫酸鈉（Na2SO3,，MW=126.04）,，攪拌溶解，冷卻后移入1000mL 容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL,，充分混勻,。
4、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8支洗凈烘干的25mL 具塞刻度試管,，編號(hào)后依次加入0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml 1.2ml1.4ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后用蒸餾水分別定容至2.0ml,。配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后,，向各試管中加入1.5mL DNS溶液,，搖勻后放入水浴鍋中沸水浴5min，取出冷卻后用蒸餾水定容至25mL,，充分混勻,。在540nm 波長(zhǎng)下，以1號(hào)試管溶液作為空白對(duì)照,，調(diào)零點(diǎn),，測(cè)定其它各管溶液的光密度值并記錄結(jié)果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo),，以對(duì)應(yīng)的光密度值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。
二,、濾紙對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響分析：由于濾紙中也含有一定量的還原性糖,，所以試驗(yàn)中應(yīng)該排除底物對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。稱取等量碾碎的濾紙與DNS充分反應(yīng),，測(cè)其OD值,。
三、酶促反應(yīng)時(shí)間的研究：酶的反應(yīng)時(shí)間不同,，其產(chǎn)物濃度也不一樣,。依次取反應(yīng)時(shí)間為0min 2min 4min 6min 8min 10min 12min14min的反應(yīng)體系，加入DNS充分顯色測(cè)其OD值,。
四,、DNS試劑量的確定：DNS本身也具有一定的顏色，如果過(guò)量也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響,，所以應(yīng)該設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定DNS的加入量,。取相同酶反應(yīng)體系，分別加入0.3ml 0.6ml 0.9ml 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml顯色劑DNS充分顯色，測(cè)其OD值,。
五,、吸收波長(zhǎng)的確定：取450nm-590nm波長(zhǎng)段，以每20nm一個(gè)區(qū)段,，分別測(cè)其OD值,，分析結(jié)果。
六,、沸水浴顯色時(shí)間的確定：取相同酶反應(yīng)體系,，DNS沸水顯色分別取1min 3min 5min 7min 9min 11min 13min 15min的OD值，分析結(jié)果,。
七、顯色后吸光度穩(wěn)定性的研究：分別測(cè)量反應(yīng)體系顯色后15min 20min 25min 30min 35min 40min 45min 50min的吸光度,，分析結(jié)果,。
以上內(nèi)容僅供參考，如需了解詳情請(qǐng)聯(lián)系喆圖客服,。
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