細胞裂解與蛋白質定量
Solarbio提供的細胞裂解液：
貨號 | R0010 | R0020 | R0030 |
名稱 | RIPA組織細胞裂解液 | RIPA組織細胞裂解液 | 非變性組織細胞裂解液 |
有效裂解成分 | SDS,，NP-40，脫氧膽酸鈉,， | 1% NP-40,，0.1% SDS | NP-40，Triton X-100 |
裂解強度 | 強 | 中 | 溫和 |
蛋白酶抑制劑 | 含, 配有PMSF | 含,，配有PMSF | 含,，配有PMSF |
產(chǎn)物 | 細胞總蛋白 | 細胞總蛋白 | 細胞總蛋白 |
蛋白狀態(tài) | 變性 | 變性 | 保持活性狀態(tài) |
主要用途 | WB、IP | WB,、IP | WB, IP,co-IP |
本系列試劑隨同配送一支PMSF,，請收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存,，如發(fā)現(xiàn)有少量沉淀,，可常溫放置半小時，沉淀可消失,，不影響使用,。
使用裂解液在提取核蛋白的同時，也會將基因組一并釋放出來,，細胞量高時會造成細胞裂解液粘稠,，此時可以直接加入蛋白上樣緩沖液，煮沸再離心,，離心取上清直接上樣電泳,；若想測定濃度，可入加少量SDS（1%）,，煮沸后離心測濃度,。本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑，所以不適合使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒,，請選擇BCA法或者Lowry法檢測蛋白濃度,。
如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物,，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗,。
蛋白質定量：
蛋白含量測定是以標準蛋白作為對照，根據(jù)蛋白濃度不同,，吸光值不同而達到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光譜吸收法）來定量,，但更多的是用染料對蛋白進行染色,，利用染料與蛋白結合顯出與原染料及蛋白不同的吸光值來定量的。后一種方法應用更普遍。
蛋白定量方法的選擇,，應該考慮到蛋白結構（標準品選擇）,、蛋白溶液內干擾物等因素的影響。
| Bradford法 | BCA法 | Lowry法 |
原理 | 考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合呈藍色,，在波長595nm吸收峰 | 基于雙縮脲原理,，堿性條件下蛋白質將Cu2+還原成Cu1+，BCA螯合Cu+作為顯色劑,，產(chǎn)生蘭紫色并在562nm有吸收峰,。 | Folin－酚法，蛋白質在堿性溶液中肽鍵與Cu2+螯合,，形成蛋白質一銅復合物,，還原酚磷鉬酸產(chǎn)生藍色化合物。 |
靈敏性 | 高 微量:1-10ug/ml, 常規(guī)：100-1500ug/ml | 很高 微量:0.5-20μg/ml 常規(guī)：20-2000ug/ml | 較高 1-1500ug/ml |
干擾因素 | 強堿性緩沖液 TritonX-100 SDS等去污劑 | 螯合劑 略高濃度的還原劑 （優(yōu)勢：耐受一般濃度去污劑） | 硫酸銨,；Tris緩沖液 甘氨酸,、各種硫醇 （優(yōu)勢：適用于脂類含量高的樣品測定。耐受去垢劑如SDS） |
應用 | 快速5-15min 顏色穩(wěn)定 標準曲線有輕微的非線性 | 較快40min 較好的方法 抗干擾能力強 | 耗費時間長50min 操作要嚴格計時 顏色深淺隨不同蛋白質變化 標準曲線線性差且專一性差 |
考馬斯亮蘭G-250染料,，在酸性溶液中與蛋白質結合,，使染料的大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm,，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色,。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合,。測定快速,、簡便，只需加一種試劑,。完成一個樣品的測定,，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程,，大約只要2分鐘即可完成,，其顏色可以在1小時內保持穩(wěn)定，且在5分鐘20分鐘之間,，顏色的穩(wěn)定性好,。由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差,。去污劑,、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）干擾此法的測定,。
BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質定量方法,。該方法因快速靈敏,、穩(wěn)定可靠，對不同種類蛋白質檢測的變異系數(shù)非常小而倍備受專業(yè)人士的青睞,。該方法的原理是,，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+,，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡合物,，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線對比,，即可計算待測蛋白的濃度,。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。在組織細胞裂解實驗中,，低濃度的去垢劑SDS,，Triton X-100，Tween不影響檢測結果,，但螯合劑（EDTA,，EGTA）、還原劑（DTT,，巰基乙醇）和脂類會對檢測結果有一定影響,。實驗中，若發(fā)現(xiàn)樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高,，可試用Bradford法測定蛋白濃度,。
Lowry法蛋白質測定法是靈敏的方法之一。過去此法是應用廣泛的一種方法,，在堿性條件下,，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）,。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比,。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高,，缺點是費時間較長，要控制操作時間,，標準曲線也不是嚴格的直線形式,，且專一性較差，干擾物質較多,。
12
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務