丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離,。
聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點：
①聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N,，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物,，沒有或很少帶有離子的側(cè)基,，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用,。
②由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì),，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成 不同程度交鏈結(jié)構(gòu),，其空隙度可在一個較廣的范圍內(nèi)變化,，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子 的大小，選擇合適的凝膠成分,，使之既有適宜的空隙度,，又有比較好的機械性質(zhì)。一 般說來,，含丙烯酰胺7-7.5%的凝膠，機械性能適用于分離分子量范圍不1萬100萬物 質(zhì),，1萬以下的蛋白質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠,，而分子量特別大的可采用含 丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠易碎，小孔膠則難從管中取出,，因此當丙烯酰胺的濃度增 加時可以減少雙含丙烯酰胺,，以改進凝膠的機械性能。
③在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定,。凝膠無色透明,，易觀察，可用檢測儀直接測定,。
④丙烯酰胺是比較純的化合物,，可以精制，減少污染,。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺,。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙 丙烯酰胺稱交聯(lián)劑,，在水溶液中,，單體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的聚合反應形成凝 膠。
在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應過程中,，需要有催化劑參加,，催化劑包括引發(fā)劑和 另速劑兩部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基,，通過自由基的傳遞,，使丙烯酰胺 成為自由基，發(fā)動聚合反應,，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度,。常用的引發(fā)劑 和加速劑的配伍如下表：
聚合反應催化劑配伍
引 發(fā) 劑 加 速 劑
（NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8 DMAPN
核 黃 素 TEMED
注：(NH4)2S2O8，過硫酸胺 TEMED：N,，N,，N，N';四甲基乙二胺 DMAPN：β－二甲基胺基丙晴 用過硫酸銨引發(fā)的反應稱化學聚合反應,；用核黃素引發(fā),，需要強光照射反應液， 稱光聚合反應,。 聚丙烯酰胺聚合反應可受下列因素影響： 1,、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止,，所以在聚合過程中要使反應液與空氣 隔絕,。 2、某些材料如有機玻璃,，能抑制聚合反應,。 3,、某些化學藥物可以減慢反應速度，如赤血鹽,。 4,、溫度高聚合快，溫度低聚合慢,。 以上幾點在制備凝膠時必須加以注意,。 凝膠的篩孔，機械強度及透明度等很大程度上由凝膠的濃度和交聯(lián)決定,。每100亳升 凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度,，常用T%表達；凝膠溶液中交聯(lián)劑 占單體和交聯(lián)體總量的百分數(shù)稱為交聯(lián)度,，常用C%表示,，可用下式計算：
公 式
a：丙烯酰胺克數(shù)； b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù),；m：緩沖液體積（毫升） 凝膠濃度過高時,，凝膠硬而脆，容易破碎,；凝膠濃度太低時,，凝膠稀軟，不易操作,。
交聯(lián)度過高,，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低,，凝膠呈糊狀,。 聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對流減低擴散的能力,，而且因為它具有三 度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，某分子通過這種網(wǎng)孔的能力將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大 小和形狀，這是凝膠的分子篩作用,。由于這種分子篩作用,，這里的凝膠并不僅是單純 的支持物，因此,，在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外,，還必須注意與凝膠本 身有關(guān)的各種性質(zhì)（網(wǎng)孔的大小和形狀等）?？赏ㄟ^下式計算來選擇適當?shù)哪z網(wǎng) 孔,。
公 式
式中：P為網(wǎng)孔平均直徑，C為多聚體濃度,，d為該多聚體分子直徑（若不是卷曲的分 子應為）,，K為常數(shù),，K值取決于漲膠的幾何構(gòu)型,，假如多聚體的鏈是以近似于直角 交聯(lián)的,，則約為1.5根據(jù)此式，我們可以通過多聚體濃度C近似地計算出網(wǎng)孔直徑,，例 如已知多聚體濃度為5%,，其網(wǎng)孔平均直徑應為：
公 式
這樣的計算是粗略的，與實際情況有一定距離,，有人測定了總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液,，在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下，聚合后的網(wǎng)孔大小,，發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關(guān),，總濃度愈大，孔徑相應變小,，機械 強度增強,，與總濃度不變時，甲叉雙丙烯酰胺（Bis)的濃度在5%時孔徑小,，高于或 低于此值時,，聚合體孔徑都相對變大，凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個重要的參數(shù),，它 往往決定了電泳的分離效果,。經(jīng)過不斷的實踐，得到了如表3所示的經(jīng)驗值,，在一般情況下,，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)采用7.5%濃 度的凝膠，所得電泳結(jié)果往往是滿意的,，因此稱由此濃度組成的凝膠為“標準凝 膠”,。
對那些用于重要研究的凝膠，好是通過采用10%的一系列凝膠濃度梯進行預先試驗,，以選出適凝膠濃度,。
表3
不同分子量范圍的蛋白質(zhì)和核酸在凝膠電泳 中所選用的凝膠濃度百分率
物 質(zhì) 分子量范圍 適用的凝膠濃度（%）
蛋白質(zhì) <10 1-4×104 4×10-1×105 1-5×105 >5×105 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
核酸 <104 104-105 105-2×106 10-20 5-10 2-3.6
聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖 液,，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的,，后者是指在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩 沖液，pH值和孔徑,，不連續(xù)電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層,，從而提高分辨 能力。
蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時,，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小 和形狀等因素,。如果加入一種試劑使電荷因素消除,，那電泳遷移率就取決于分子的大 小，就可以用電泳技術(shù)測定蛋白質(zhì)的分子量,。1967年,，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑 十二烷基硫酸鈉（SDS）具有這種作用。當向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基乙 醇,，SDS可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原,。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白 質(zhì)—SDS復合物都帶上相同密度的負電荷,，它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量,， 因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后,，還可引起構(gòu)象改 變,，蛋白質(zhì)—SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復合物 的短軸長度都不一樣,，約為18A,，這樣的蛋白質(zhì)—SDS復合物，在凝膠中的遷移率,，不 再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響,，而取決于分子量的大小，因而SDS聚可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量,。
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