關鍵詞:細胞轉(zhuǎn)染服務|實驗技術(shù)服務
簡介：世界*品牌細胞轉(zhuǎn)染服務|實驗技術(shù)服務原裝,，質(zhì)量保證,*。
細胞轉(zhuǎn)染服務|實驗技術(shù)服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復我們的實驗結(jié)果。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>一、細胞傳代
1. 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),，酒精棉球,，廢液缸，試管架,，微量移液器,，記號筆，培養(yǎng)皿,，離心管,。
2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次
3. 用tip頭加入1ml Trypsin液,，消化1分鐘(37℃,，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止,。
4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。
5. 用Tip頭多次吹吸,，使細胞*分散開,。
6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中,，1000rpm離心5min。
7. 用培養(yǎng)液重懸細胞,，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿,。
8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,，使其均勻分布,。
9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染,。
二,、細胞轉(zhuǎn)染
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物,。
② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存，使用前還需震蕩,。
2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞,。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘,。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 加入混合液,，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。
6. 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時,。
三、第二次細胞傳代
1. 在轉(zhuǎn)染后24小時,，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況,。
2. 再次進行細胞傳代,，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中,。
3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細胞實驗方法
1,、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時,，將貼壁細胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2×10^5/孔左右,。
2,、第二天,，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液,。37℃孵育,。
3、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene,。
4,、繼續(xù)培養(yǎng)24小時，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基,。
5,、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白,，一般轉(zhuǎn)染48小時后可見明顯熒光表達,，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率,，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時進行,。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥,。
二,、慢病毒轉(zhuǎn)染懸浮細胞實驗方法
1、在2×10^5/ml懸浮細胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒,，充分混勻,。37℃孵育?；蛘?50g室溫離心4小時(選作,，部分難轉(zhuǎn)染的細胞系采用此步驟可以提高轉(zhuǎn)染效率)。
2,、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后(或離心結(jié)束后)加入等體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene,。
3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天,。中間視細胞生長情況可傳代或換液,。