關(guān)鍵詞:細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*。
細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)服務(wù)|實驗技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系,。
我們具備豐富的蛋白表達設(shè)計經(jīng)驗及實驗操作技巧,，承諾客戶不成功不收費。我們所有的實驗數(shù)據(jù)真實可信,，我們提供原始的表達菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實驗報告重復(fù)我們的實驗結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.,。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒灹鞒蹋?br>一、細胞傳代
1. 試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),，酒精棉球,，廢液缸，試管架,，微量移液器,，記號筆，培養(yǎng)皿,，離心管,。
2. 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次
3. 用tip頭加入1ml Trypsin液,，消化1分鐘(37℃,，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細胞*從壁上脫落下來為止,。
4. 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng),。
5. 用Tip頭多次吹吸,，使細胞*分散開。
6. 將培養(yǎng)液裝入離心管中,，1000rpm離心5min,。
7. 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿,。
8. 將合適體積*培養(yǎng)液加入離心管中,，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布,。
9. 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，第二天轉(zhuǎn)染。
二,、細胞轉(zhuǎn)染
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準備
① 將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物。
② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。
2. 選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩,。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘,。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。
5. 加入混合液,，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6. 到時后,，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,，之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
三,、第二次細胞傳代
1. 在轉(zhuǎn)染后24小時,，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。
2. 再次進行細胞傳代,，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中,。
3. 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
慢病毒轉(zhuǎn)染貼壁細胞實驗方法
1,、慢病毒轉(zhuǎn)染前18-24小時,，將貼壁細胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2×10^5/孔左右,。
2,、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,，加入適量病毒懸液,。37℃孵育。
3,、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene,。
4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時,，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基,。
5、繼續(xù)培養(yǎng),。如果慢病毒含有熒光蛋白,，一般轉(zhuǎn)染48小時后可見明顯熒光表達,，72小時后更加明顯。如需FACS檢測轉(zhuǎn)染效率,，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時進行,。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥,。
1.  在6孔板中接種1~3×105細胞/孔,，加入2ml*培養(yǎng)基，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng),。
2.  待細胞長到50-80%單層時,，在無菌離心管中配制如下溶液：
i.  溶液A：將4?g待轉(zhuǎn)染的超純DNA稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中，靜置5min
ii.  溶液B：將2-25?l LipofectAMINE 稀釋到250?l無血清培養(yǎng)基中,，靜置5min
3.  混合溶液A和B,，輕輕混勻，室溫放置15-45min,。
4.  用2ml無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌細胞,，加入0.8ml無血清培養(yǎng)基/孔，將脂質(zhì)體復(fù)合物滴加到孔中,，輕輕搖晃混勻,，置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr。
5.  用*培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染液,，繼續(xù)培養(yǎng),。
6.  24-72hr后檢測蛋白質(zhì)的表達或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩(wěn)定表達株。