| 1．固定：用4%的多聚甲醛固定液,。對于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好,；但對于不同的組織和抗原,，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液,，請于購置前注意說明書,。 Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml,，冰醋酸50ml,，其對組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好,，結(jié)構(gòu)完整,，但因偏酸，對抗原有一定損害,，且組織收縮明顯,，不適于組織標(biāo)本的長期保存。 PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,，適于固定石蠟切片,。適于富含糖類組織，對超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好,。 2．組織脫水,，透明：時(shí)間不能太長，否則在切片時(shí)容易碎片,，切不完整. 3．切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?/div> 4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過夜,，溫度太高或時(shí)間太長,，抗原容易丟失。 5．蠟塊及切片的保存：在4℃保存 6．脫片問題： Poly-L-Lysine（多聚賴氨酸）為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑,，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,，適合于需要酶消化、微波,、高溫高壓的防脫片處理,。如不行,，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,，可用如下方法：切片在脫蠟前,，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干,，即可進(jìn)行下一步,。 7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活,。 8．暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇,，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度（不同抗體的*修復(fù)液請參閱抗體說明書）,。對于不同的組織，不同的抗原,，不同的抗體,，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù),、胰酶消化,、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等,。 9．封閉：在山羊血清封閉,，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉 10．抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,，對于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用,。 11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間,、反應(yīng)溫度等合適的條件下,，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗,，特別是在顯色之前要多洗,。 12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán),。 13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察,，注意控制背景。 14．在整個(gè)操作過程中,，切片千萬不能干燥,，否則會有非特異性染色 |
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