一,、原理
（一）什么是熒光,，簡單地講，當(dāng)用一定波長的光（如紫外光）照射某種物質(zhì)時,，經(jīng)過照射的物質(zhì)在極短時間內(nèi)即可發(fā)射出一種可見的光,，這種光即為熒光。
在生物中,，由于產(chǎn)生熒光的方式不同,，可以概括地歸納為以下幾種：
1． 自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光（或直接熒光）,。如植物組織中的葉綠素,，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光,。
2． 次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外線照射后,，并不能發(fā)出熒光，但是當(dāng)它吸收熒光染料后也可以產(chǎn)生熒光,，這種稱為次生熒光（或間接熒光）,。如吖啶橙,，DAPI均可檢測細胞內(nèi)的核酸。
3． 免疫熒光：這種染色法是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理,，將熒光染料與抗體結(jié)合,，然后，將這種標(biāo)記熒光染料的抗體再與相應(yīng)抗原結(jié)合,，即形成抗原,、抗體復(fù)合物。經(jīng)一定波長的光激發(fā)后,，即可發(fā)射出熒光,，以此辨認(rèn)抗原在組織細胞內(nèi)的分布狀況。這種方法被稱為免疫熒光（或熒光抗體法）,。
組織和細胞中所產(chǎn)生的熒光,，須借助熒光顯微鏡方可進行觀察，本實驗是用普通顯微鏡配以一種輕便的熒光光源觀察熒光現(xiàn)象,。
（二）輕便落射光裝置
落射光裝置的組成：此裝置是為普通顯微鏡配套設(shè)計的,。它是由兩部分組成，一為光源,；另一為落射光系統(tǒng),，如圖，落射光系統(tǒng)由激發(fā)濾片組成,。當(dāng)光線通過激發(fā)濾片到達二向分光鏡時,，使激發(fā)光反射，經(jīng)物鏡后,，激發(fā)標(biāo)本,，標(biāo)本輻射熒光，又通過物鏡,，分光鏡而到達目鏡,，以供觀察者觀察及記錄。
二,、目的與要求
初步了解生物熒光及熒光染色法,，學(xué)習(xí)幾種生物熒光標(biāo)本的制作與觀察。
三,、實驗內(nèi)容
（一）生物自發(fā)熒光的觀察
（二）生物的熒光染色法
（三）熒光抗體法
四,、實驗步驟
（一）生物自發(fā)熒光的觀察
1. 制片
（1）取一干凈載玻片
（2）用吸管吸取眼蟲培養(yǎng)物，滴于載玻片的中央位置,。
（3）用鑷子取一張蓋玻片,，沿液體的邊緣輕輕的蓋上蓋玻片。
（4）用吸水紙將蓋玻片周邊的多余水吸掉,。
2. 觀察
（1）將載玻片置于顯微鏡載物臺上,。
（2）調(diào)節(jié)好光源,。可觀察,。注意眼蟲的葉綠體呈現(xiàn)何種顏色,？
（二） 吖啶橙染色法
吖啶橙是一種經(jīng)常使用的熒光染料，它對細胞中的DNA和RNA可同時染色,，但顯示的顏色卻是有差異的,。DNA呈綠色熒光，RNA呈桔紅色,。
1． 制片
（1）取一干凈載玻片,，滴一小滴蛋白膠于載玻片上,，涂均勻,。稍干。
（2）吸取四膜蟲培養(yǎng)液,，滴于載玻片中央,，待培養(yǎng)液似干未干時，滴加Carnoy’s液固定蟲體5－10分鐘,。
（3）將載玻片放入70％酒精中,，停留1－2分鐘，然后轉(zhuǎn)入蒸餾水中,。
（4）取出載玻片,，吸出載玻片上多余水份，轉(zhuǎn)入1％冰醋酸中,，停留30秒－1分鐘,，再轉(zhuǎn)入蒸餾水。
（5）將載片放入0.1％吖啶橙液（pH4.8～6.0）中,，染色1－3分鐘,。
（6）將載玻片放入PBS（pH6.0）液中。
（7）將載玻片放入0.1MCaCl中,，分化30秒－2分鐘,。
（8）轉(zhuǎn)入PBS液中。換3次,，每次2－3分鐘,。
（9）在標(biāo)本處，滴加PBS－甘油液,，輕輕加上蓋玻片,。
2． 觀察
（1） 用吸水紙，吸去載玻片上多余的水份,。
（2） 將標(biāo)本置于顯微鏡載物臺上,，調(diào)好光源,。即可觀察。在顯微鏡下,，細胞中DNA部位呈黃綠色（細胞核）,，RNA呈桔紅色（細胞質(zhì)及核仁）。
（三） 熒光抗體法
熒光抗體染色法,，根據(jù)染色步驟的不同,，分為兩種。一種為直接染色法,，就是將熒光素直接與*抗體結(jié)合,，然后，進行抗原抗體反應(yīng),。另一種為間接染色法,，就是將熒光素與第二抗體結(jié)合。此法需進行兩次抗原,、抗體反應(yīng),。
本實驗選用的是間接染色法，反應(yīng)所用一抗為免抗四膜蟲抗體,。二抗為羊抗兔FITC抗體,，具體操作步驟如下：
1． 制片
（1） 固定細胞
①取一干凈載玻片，畫定樣品區(qū)域（直徑0.5cm圓圈）,，加四膜蟲,，風(fēng)干。
②待涂片似干未干時,，滴加丙酮：乙醇（1：1）液,，固定細胞5～10分鐘。
③將載玻片放入PBS液中,，經(jīng)過3次,，每次3－5分鐘。
（2） *步抗原－抗體反應(yīng)
①將載玻片上多余的水擦干,，取10ml二抗滴于標(biāo)本上,，放于濕皿內(nèi)，置于37°C,，溫育40分鐘,。
②取出玻片，經(jīng)PBS液洗3－5次,。每次各5分鐘,。
（3） 第二步抗原、抗體反應(yīng)
①取10～20ml二抗滴于標(biāo)本上,，放于濕皿內(nèi),，置于37°C,，溫育40分鐘。
②取出載玻片,，經(jīng)PBS液洗3～5次,，每次各5分鐘。
（4） 封片
將載玻片上多余的水份擦干,，在標(biāo)本處滴一小滴PBS：甘油液,，輕輕加上蓋玻片。
2． 觀察
（1） 吸去邊緣多余液體,，將載玻片放在顯微鏡載物臺上,。
（2） 調(diào)好光源即可觀察。FITC熒光色素呈黃綠色熒光,，觀察你的標(biāo)本中,，在細胞的哪些部位有陽性反應(yīng)。
五,、實驗用品
（一）實驗材料：眼蟲,、四膜蟲,、兔
（二）試劑：0.1％吖啶橙染色液,，PBS（pH6.0）液，1％醋酸,，0.1MCaCl2,、蛋白膠、蒸餾水,、甘油,、PBS（1：9）液，抗體（一抗及二抗）,，70％酒精,，卡氏固定液，乙醇丙酮（1：1）固定液,。
（三）器皿：顯微鏡,、輕便熒光光源、載玻片,、蓋玻片,、鑷子、染色缸6個,、培養(yǎng)皿（9.5cm）5個,、培養(yǎng)皿（12.5cm）/個。
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