所有產(chǎn)品僅供科研使用,，不能用于食用和醫(yī)療等

明膠酶譜法試劑盒

描述：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌,，活化后能夠降解 細胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶,。通過影響細胞外基質(zhì),，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生,、組 織重塑等過程,，并參與炎癥、腫瘤,、心血管,、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的 MMP-2,、MMP-9 參與各種生理與病理過程,，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視   1。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2,、MMP-9  活性,。Zymography  是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法,，其靈敏度可達 1 nM,，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠,，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電 泳， 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育,，凝膠染色與脫色,。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景,，但在有蛋白酶條帶的位置,，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域，從而能同時指示 MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性,。本試劑盒提供

MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液,，可檢測少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2,、MMP- 9 酶譜及活性，檢 測靈敏度~1 nM,。試劑盒可進行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測,，如果小膠加樣孔為 10~15個，則總計可檢測 500~750 個樣品,。

明膠酶譜法試劑盒

適用: 檢測 MMP-2,、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 組成與儲存 (50 assays)：

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, ?20 ºC,；
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 ºC,；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋,；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液, 4 ºC,。

檢測步驟：

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠,。將 10 × substrate G 融化,，并 90 ºC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍,，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED,，等待凝膠聚合。

2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),，混合后直接上樣,。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液,?？赏ㄟ^預(yù)試驗確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染  Marker   即可,。陽 性對照(可選步驟)：可取人,、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體積混合,，取 5-15µl 上樣,。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20    mA/gel,。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳,。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠,，去除濃縮膠，放入容器內(nèi),?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入  10    ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋),，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘,。中間換液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A,。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋),，室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示,。如 MMP 活性低,，應(yīng)延長孵育時間為 10 小時或 過一夜。

6.  顯色：倒掉 Buffer B,，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書）,。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域,。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2,、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2),、92 (MMP-9),、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶,。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描,。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑,。解決 辦法：可用非透射光掃描,，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑 色,。MMP 條帶則為白色,，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

 說明

1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性,。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠,，作為記錄保留。

參考文獻：

1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem,，1980, 102, 196–202
 

SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書

常規(guī)考馬斯亮藍 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實驗室常用的凝膠染色方法,。銀染方法雖然靈敏度 高，但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害,，操作步驟繁瑣,，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液,，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠,，并緩慢搖動 2h；

2. 傾去染色液,，用脫色液沖洗凝膠,；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動 2h,，傾去脫色液,，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的 藍色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要 2～4h,，也可脫色過一夜至清晰的藍色的條帶和干凈 的背景）,；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在    7％的乙酸中保存,。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對 凝膠進行處理后保存。

安全性：含有甲醇，無特殊毒性,，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理,。

說明：

1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍 R250 420ml 甲醇 100ml 冰乙酸，定容至 1000ml,，混合 1h 后用 Whatman 1 號濾紙過濾,，于室溫可無限期保存；

2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）,；

3. 保存液：7％冰醋酸,；

4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用,，裝入新容器內(nèi),，室溫或 4 ºC 保存，可反復(fù)使用 2-4 次,。

 明膠酶譜法試劑盒