在基因組測序中,，PCR擴(kuò)增似乎是繞不過去的一步,。然而,，PCR也帶來一些問題,，包括不均勻擴(kuò)增，導(dǎo)致某些序列的比例過高,。對目前的新一代測序（NGS）平臺而言,，測序某些堿基組成上存在嚴(yán)重偏向的基因組區(qū)域仍是一大挑戰(zhàn),。在GEN雜志上，Patricia Fitzpatrick Dimond博士介紹了PCR-Free的基因組測序,。

文庫制備的變革

2009年,，Sanger研究院的Iwanka Kozarewa博士及其同事介紹了一種無需擴(kuò)增的Illumina文庫制備方法（Nature Methods 2009;6:291–295）。他們表示,，GC偏向的基因組的定位和組裝有所改善,。這種方法采用簇?cái)U(kuò)增步驟來富集*連接的模板鏈，降低了重復(fù)序列的發(fā)生率,，改善了序列定位和SNP檢出,。

這種方法的核心是采用no-PCR接頭，它們包含額外的序列,，讓模板能夠與流動槽表面直接雜交,，這樣就不再需要PCR步驟。作者表示,，通過此方法產(chǎn)生的DNA模板量低于PCR方法,，但定量研究表明，從5 μg起始DNA中獲得的文庫足夠400個(gè)GA通道的測序,，這滿足了大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)需求,。此外，由于省去了PCR步驟,，這種方法比標(biāo)準(zhǔn)的文庫制備更快,。

Illumina的產(chǎn)品Rooz Golshani表示：“我們的PCR-free產(chǎn)品，TruSeq® DNA PCR-Free Library Preparation Kit,，是金標(biāo)準(zhǔn),，也是產(chǎn)生zui完整基因組的*方案。”Golshani博士指出,，研究人員在需要避免PCR相關(guān)的偏向時(shí),，往往采用此試劑盒來制備文庫。

2015年,，J. Craig Venter研究所的Marcus B. Jones及其同事指出,，隨著全基因組測序被廣泛用于人類微生物組研究，研究結(jié)果往往被證明是沖突或不確定的（Proc Natl Acad Sci USA 2015;10;112:14024-9）,。

研究人員開展定量和定性分析來比較WGS宏基因組數(shù)據(jù),。他們采用Illumina Nextera XT和TruSeq DNA PCR-Free以及KAPA Biosystems的Hyper Prep PCR和PCR-Free系統(tǒng)。研究表明,，這四種不同的NGS文庫制備導(dǎo)致分類出現(xiàn)明顯差異,。根據(jù)分析的結(jié)果，他們建議從事微生物組研究的研究人員采用PCR-free的方法來減少PCR偏向，從而獲得更準(zhǔn)確的分類信息,。

納米孔測序

這些PCR-free的技術(shù)都是針對Illumina的測序儀開發(fā)的,，不過，一種顛覆性的測序技術(shù)已經(jīng)*改變DNA測序的方式,，這就是納米孔測序,。

Oxford Nanopore Technologies開發(fā)的手機(jī)大小的MinION測序儀有望zui終拋棄PCR。它讀取長的DNA片段,，不過目前仍需要文庫制備,。這種方法在分辨重復(fù)序列或單體型上具有優(yōu)勢，因?yàn)閱蝹€(gè)測序片段就能跨越含糊不清的區(qū)域,。未來,，這種設(shè)備有望用于實(shí)時(shí)醫(yī)療診斷和法醫(yī)檢驗(yàn)。

不過,，英國研究人員認(rèn)為,，在廣泛采用MinION之前，需要評估其通量和準(zhǔn)確性（Biomol Detect Quantif 2015;3: 1–8）,。他們利用MinION對三個(gè)細(xì)菌基因組進(jìn)行重測序,，這些有著不同的核苷酸組成。研究人員發(fā)現(xiàn),，MinION堿基檢出后的錯(cuò)誤率為38.2%,。讀長平均值和中值分別為2 kb和1 kb，而zui長的序列達(dá)到98 kb,。作者認(rèn)為,，盡管錯(cuò)誤率限制了MinION的競爭能力，但是與Illumina MiSeq的數(shù)據(jù)相結(jié)合,，MinION的序列數(shù)據(jù)可增強(qiáng)de novo組裝,。

隨著MinION的試用報(bào)告不斷出爐，人們發(fā)現(xiàn),，MinION本身也能做很多事情,。它能可靠地測序小型基因組，如細(xì)菌和酵母,。它也能區(qū)分親緣關(guān)系很近的細(xì)菌和病毒，讀取人類基因組中的復(fù)雜區(qū)域,，并區(qū)分一對染色體上的兩個(gè)基因版本,。此外，傳染病檢測也有望成為這種手持式測序儀的一大應(yīng)用,。

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