RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)又稱(chēng)為RIP（RNA immunoprecipitation），可以說(shuō)是RNA版的ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）,，該技術(shù)能幫助人們分析與RNA結(jié)合蛋白相關(guān)的核酸,。

在RIP試劑盒（如Sigma的Imprint® RNA Immunoprecipitation kit）的幫助下，研究者們能夠利用針對(duì)RNA結(jié)合蛋白的抗體,，從細(xì)胞提取物中捕獲與蛋白相結(jié)合的RNA,，再通過(guò)qPCR、芯片或二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這些RNA進(jìn)行鑒定。

不論是細(xì)胞質(zhì)還是細(xì)胞核,，都會(huì)發(fā)生RNA與蛋白的相互作用,。據(jù)Active Motif公司產(chǎn)品Kyle Hondorp介紹，該公司的RNA ChIP-IT® kit于研究RNA與細(xì)胞核染色質(zhì)的相互作用,。該試劑盒通過(guò)甲醛固定來(lái)鎖定RNA-染色質(zhì)的互作,，隨后對(duì)染色質(zhì)進(jìn)行超聲，并用DNAse I處理,，zui后利用磁珠進(jìn)行沉淀,。

“如你研究的是總mRNA，那么常規(guī)RIP試劑盒更合適一些,，”Hondorp說(shuō),，“常規(guī)RIP試劑盒可以處理所有細(xì)胞裂解物的總mRNA。”

生物試劑Magna RIP™ RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司,，也在開(kāi)發(fā)專(zhuān)門(mén)針對(duì)染色質(zhì)的RIP試劑盒,。預(yù)計(jì)這一新產(chǎn)品將于2014年*季度發(fā)布，該產(chǎn)品有化學(xué)交聯(lián)與native兩種形式,。據(jù)介紹,，化學(xué)交聯(lián)可以分析究間接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白復(fù)合物,。而native方法展現(xiàn)的是,，親和力更高也更為直接的相互作用。

除RIP以外,，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以幫助人們捕捉與RNA結(jié)合蛋白互作的核酸,。CLIP方案整合了交聯(lián)與核酸酶消化，不僅允許對(duì)RNA-蛋白復(fù)合物進(jìn)行進(jìn)一步的純化（如凝膠電泳片段分離）,，還能夠揭示RNA-蛋白互作所發(fā)生的位點(diǎn),。zui近人們又開(kāi)發(fā)出了新型CLIP 技術(shù)——iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），該技術(shù)能夠以單個(gè)堿基的分辨率,，來(lái)展示RNA-蛋白互作的詳細(xì)信息,。

據(jù)倫敦大學(xué)學(xué)院的Jernej Ule教授介紹，CLIP與RIP的關(guān)鍵性差異,，在于沉淀復(fù)合物后的凝膠純化步驟,。CLIP技術(shù)可以給RNA-蛋白復(fù)合物的RNA末端帶上放射性標(biāo)記，并將這些復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE分離,，之后轉(zhuǎn)移到一張膜上,。這樣的過(guò)程可以提高純化的特異性，減少非特異性的RNA,。蛋白酶消化可以將RNA從膜上解離下來(lái),，用于制備cDNA文庫(kù),，以備測(cè)序分析。

“CLIP要比RIP麻煩一些,，不過(guò)我認(rèn)為它很值得采用,，”Ule說(shuō),。“放射性信號(hào)的量及其特異性,，能夠幫助我們提高cDNA文庫(kù)的質(zhì)量，zui終得到準(zhǔn)確實(shí)用的數(shù)據(jù),。”

ChIRP,、CHART和RAP

如果你對(duì)某種RNA感興趣,，希望研究與其發(fā)生相互作用的蛋白，就需要采用新的實(shí)驗(yàn)方案,。ChIRP（chromatin isolation by RNA purification）,、CHART（capture hybridization analysis of RNA targets）和RAP（RNA antisense purification）都基于同樣的理念，將與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行生物素標(biāo)記,，并由此捕獲相關(guān)蛋白,。之后研究者可以通過(guò)二代測(cè)序或質(zhì)譜分析，來(lái)鑒定與RNA互作的蛋白,，明確發(fā)生這些互作的基因組區(qū)域,。

據(jù)NEB的G. Brett Robb介紹，上述三種方法解決了當(dāng)今RNA生物學(xué)中的關(guān)鍵需求,。目前，研究者們已經(jīng)鑒定了大量的lncRNA,，但卻不清楚它們的功能,。“解決這一問(wèn)題的途徑之一，就是尋找與這些RNA發(fā)生互作的蛋白,。”舉例來(lái)說(shuō),，加州理工學(xué)院的Mitchell Guttman和賓州大學(xué)的Jeannie Lee，就分別在使用RAP和CHART對(duì)Xist lncRNA展開(kāi)研究,。

據(jù)悉,，目前ChIRP、CHART和RAP技術(shù)都還沒(méi)有商業(yè)化,。不過(guò)有一個(gè)試劑盒可以實(shí)現(xiàn)從已知RNA分離蛋白,，即MBL International的RiboTrap系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA（帶生物素標(biāo)記）,，從細(xì)胞提取物中分離與之結(jié)合的蛋白,。

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