信帆生物分享：ELISA技術(shù)測定單克隆抗體效價方法

一,、實驗?zāi)康?/p>

1.深入了解elisa 法測定抗體效價的原理,。

2.掌握ELISA 法測定單克隆抗體效價的方法。

二,、實驗原理

ELISA 是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù),。免疫酶技術(shù)是將酶標記在抗體/抗原分子上,，形成酶標抗體/酶標抗原，稱為酶結(jié)合物,。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后,，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺,，定位或定量抗原/抗體,。ELISA 法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體,，使之固相化,，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌,，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系,，也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中.酶促反應(yīng)只進行一次,，而抗原,、抗體的免疫反應(yīng)可進行一次或數(shù)次，即可用二抗(抗抗體),、三抗再次進行免疫反應(yīng),。

目前常用的幾種ELISA 方法有：測定抗體的間接法，測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等,。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價,。其主要過程為：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi)，加待測抗體,，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì),，加酶標抗抗體，保溫后洗滌,，加底物保溫30分鐘后,，加酸或堿終止酶促反應(yīng)，用目測或光電比色測定抗體含量,。

三,、儀器,、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標板,、微量移液管,、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋,。

原料

單克隆抗體

試劑

1. 抗原及酶標記抗體

①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG,，Code No.A0423);

②酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No.P0260);均為

DAKO 公司產(chǎn)品,，使用時按照說明書要求稀釋,。

4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL。

5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白,，0.1%Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA,，10μLTween-20。

6. 底物溶液

①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g,，NaH2PO4·2H2O 6.84g,，用蒸餾水溶解，定容至500mL,。

② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中,，4℃避光保存。

③底物應(yīng)用液：現(xiàn)用現(xiàn)配,，磷酸鈉緩沖液10mL,，TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL,，混勻,。

7. 終止液：2mol/LH2SO4

四、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原,，用包被液l：8000稀釋,，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板

中。4℃放置過一夜,。

②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體,，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液,，室溫放置0.5h,。

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10),，100μL /孔加到已包被的板上,，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,，已知樣品作為陽性對照,。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h,。

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP,，用封閉液l ：8000稀釋,，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h,。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次,，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔,，室溫暗處放置5～30min,，顯示藍色。

⑩終止反應(yīng),、比色：加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值,，陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測樣品的效價。

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