ELISA實(shí)驗(yàn)代測：如何正確的進(jìn)行ELISA測定操作

一、研究標(biāo)本的收集和保存

　　用于ELISA測定的研究標(biāo)本zui為常用的是血清（漿）,，有時因?yàn)樘囟ǖ臋z測目的，也用到唾液,、腦脊液,、尿液、糞便等標(biāo)本,。目前研究上使用血清標(biāo)本測定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)志物、激素,、特種蛋白,、細(xì)胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標(biāo)本的收集,，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響,。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會有一峰值出現(xiàn)：生長激素,、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發(fā)性方式釋放,，因此，在測定此類激素時,，有必要在密切相連的時間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本,，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r,，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高,。再如治療藥物的檢測,，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的zui適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體,、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測的血清標(biāo)本的收集則沒有時間和體位方面的影響,，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：

　　（1）要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血,。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán),，其有類似過氧化物的活性，因此,，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中,，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相,，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色,。

　　（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染,，一則細(xì)菌的生長,，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾,。

　?。?）血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周,，如為有菌操作,，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存,，應(yīng)在-70℃以下,。

　　（4）冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融,。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,，從而引起假陰性結(jié)果。此外,，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意,，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可,。

　?。?）標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測,。

　　二,、試劑準(zhǔn)備

　　在研究實(shí)驗(yàn)室，對試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是,，在實(shí)驗(yàn)時將試劑從冰箱中拿出來即用,，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標(biāo)本的檢測出現(xiàn)假陰性,。因此在ELISA測定中試劑的準(zhǔn)備zui為關(guān)鍵的是,，在實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來,，在室溫下放置20分鐘以上后,，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡,。這樣做的目的,，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度,，以滿足測定要求,。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制,，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量,。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時,，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時配制,。

　　三、加血清樣本及反應(yīng)試劑 本

　　在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中,，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快,，要避免加在孔壁上部,，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性,。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染,。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加,，除了要注意滴加的角度外,，滴加的速度也很重要，滴加太快,，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象,，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色,。所以,，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性,，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致,。