信帆生物為大家提供：Western blot實(shí)驗(yàn)步驟詳解

一.實(shí)驗(yàn)步驟

1. 組織塊稱重

2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊

3. 加入RIPA緩沖液(每克組織3 ml RIPA),，PMSF(每克組織30μl,，10 mg/ml PMSF),，利用Polytron進(jìn)一步勻漿(15,000轉(zhuǎn)/分*1分鐘)維持4℃

4. 加入PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF),，冰上孵育30分鐘

5. 移入離心管4℃ 約20,000 g(約15,000轉(zhuǎn))15分鐘

6. 上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存

7. 進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度

8. 取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液(體積*蛋白質(zhì)濃度),，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液

9. 沸水浴中3分鐘

10. 上樣

11. 電泳(濃縮膠20mA，分離膠35mA)

12. 電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜(100mA 40分鐘)

13. 膜用麗春紅染色,，膠用考馬斯亮藍(lán)染色

14. Westernblot 試劑盒顯色

15. 分析比較記錄

western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料

1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,。

1)轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡,。

2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間,，保持濕潤和沒有氣泡,。

3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極,。

4)將上述裝置放入緩沖液槽中,，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠。

5)按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移,。

6)轉(zhuǎn)移結(jié)束后,，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠,。

2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置,。

3. 用100ml水洗滌纖維素膜,，必要時可用脫色緩沖液。

4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時,。

5. 室溫下,，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜,。

6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣,。

7.袋的一角剪一緩沖液的小口,，用透析袋夾緊。

8.混合：NGS(100微升),，印跡緩沖液中的抗體(10毫升),，加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時(或4℃過一夜)

9.用總體積300ml PBS-Tween緩沖液,，分4次在一淺盤中洗滌薄膜,，每次75ml。

10. 將連接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內(nèi),，于室溫下?lián)u動1小時。

11.按步驟9洗滌,。

12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS),，于室溫下?lián)u動。

注意事項(xiàng)：

western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài),，空間結(jié)構(gòu)改變,，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白物素化,，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot,。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。

Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作,。

1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生物試劑的Western及IP細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞,、懸浮細(xì)胞或組織樣品,。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白,、細(xì)胞漿蛋白,、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提,，例如碧云天生物試劑的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。收集完蛋白樣品后,，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致,，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法,。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大,。如果使用碧云天生物試劑的Western及IP細(xì)胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒,。

2. 電泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制,，也可以使用碧云天生物試劑的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方,。

(2) 樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品,。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生物試劑的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X),。

100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,，以充分變性蛋白.

(3) 上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可,。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),。

電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳,，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置,，低電壓可以設(shè)置在80-100V,，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求,，也可以采用碧云天的多功能電泳儀(帶定時),。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式,，通常把電壓設(shè)置在100V,，然后設(shè)定定時時間為90-120分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭,。通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳,，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳,。

3. 轉(zhuǎn)膜(Transfer)

我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜,。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆,，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開,。膜的使用請參考生物試劑商的推薦使用步驟。

通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置,，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA,，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘,。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過一夜。轉(zhuǎn)膜時也可以使用碧云天的多功能電泳儀(帶定時),。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定,，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長,，目的蛋白的分子量越小,，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。

在轉(zhuǎn)膜過程中,，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時,，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,。

轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色,，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果,。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況,。

4. 封閉(Blocking)

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中,，漂洗1-2分鐘,，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟,，一定要注意膜的保濕,，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。

用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘,。對于一些背景較高的抗體,，可以在4℃ 封閉過一夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天生物試劑的側(cè)擺搖床,，側(cè)向擺動速度比較緩慢,，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書,，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗,。

用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗,，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時,。如果一抗孵育一小時效果不佳,，可以在4℃緩慢搖動孵育過一夜。

回收一抗,。加入Western洗滌液,，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后,，再加入洗滌液,，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次,。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù),。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗,。用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時,。

回收二抗,。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘,。吸盡洗滌液后,，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘,。共洗滌3次,。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

7. 蛋白檢測(Detection of proteins)

參考相關(guān)說明書,，使用BeyoECL, Western 熒光檢測試劑等ECL類試劑來檢測蛋白,。

洗片時可以使用X光片自動洗片機(jī)。如果沒有自動洗片機(jī),，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片,。

8. 膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)

如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜,，以重復(fù)利用蛋白膜,。