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免疫組化（IHC）的原理是,，根據(jù)抗體與抗原的特異結(jié)合來檢測組織切片中的抗原（如蛋白）。詞根immuno是指操作中所使用的抗體,，而histo代表著組織,。

利用特異的腫瘤標(biāo)志物，醫(yī)生們可以通過IHC診斷腫瘤是良性還是惡性,，確定腫瘤的分期和分級,，鑒別細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)移的來源。IHC也能用于藥物開發(fā),，研究者們通過檢測靶點的上調(diào)或下調(diào)來判斷藥物的療效,。

商業(yè)化的IHC抗體一般都提供有稀釋和染色的建議，能為你節(jié)省許多摸索過程,。然而,，事情往往沒那么簡單。你的抗體可能沒在IHC中驗證過,，或者你的樣本并不標(biāo)準(zhǔn),，又或者實驗就是不像文獻或演示視頻那樣順利，這時我們該怎么辦呢,？

“IHC不只與一抗有關(guān),，還有緩沖液、抗原修復(fù)液和酶,，”紐約大學(xué)Langone醫(yī)學(xué)中心的IHC主管Luis Chiriboga說,，“這些都是重要的變量。”平衡這些變量是一件相當(dāng)繁瑣事,，而本文介紹的一些小竅門可以幫你簡化這一過程,。

首先要有信號

Chiriboga在教學(xué)生做IHC時總會說，生成信號是*要務(wù),。“你必須先看到信號,，才知道接下來要怎么做。” 一開始他通常使用較高的抗體濃度,，在抗原表達水平不同的組織中進行測試,，以便獲得一個動態(tài)范圍。

不過,，調(diào)整信號就不只是抗體的問題了,。“高品質(zhì)抗體是*要素。但如果用錯了其它試劑,，好抗體也會失敗,，”CST公司的Katherine Crosby說。

緩沖系統(tǒng)對一抗結(jié)合抗原的能力有著深遠(yuǎn)的影響,。如果你用了抗體供應(yīng)商推薦的試劑和方案但卻沒有看到理想的結(jié)果,，就應(yīng)該及時供應(yīng)商的。如果你用的是經(jīng)未測試的抗體,，就有必要對pH或離子強度進行調(diào)節(jié),。

如果實驗仍然檢測不到組織里的抗原，但該抗原的確有表達,，那么可能是抗原表位在固定過程中出了問題（比如被掩蓋或變性）,。在這種情況下，我們就需要對抗原進行修復(fù),。目前的抗原修復(fù)基本上是酶處理（比如pronase或trypsin）或者某種形式的加熱,，Sigma Aldrich公司的Lynn Stephenson說。

另外,，我們還可以嘗試不同的固定劑,，用乙醇、甲醇甚至丙酮來取代福爾馬林,。“這些試劑會使抗原表位產(chǎn)生不同的改變,，”Stephenson指出。

更好的標(biāo)記體系

一般情況下,，抗原識別只是整個過程的一部分,。經(jīng)典IHC方案是用二抗來識別一抗。二抗可以與辣根過氧化物酶（HRP）直接相連,，不過更多情況是先用二抗連接生物素,，然后用連有酶的鏈霉親和素來進行識別。這樣能形成一個多層次的信號放大系統(tǒng),。

“不過,，這樣的系統(tǒng)也可能帶來更多的誤差和背景,，”Sigma Aldrich公司的Aaron Sin說。舉例來說,，親和素可能識別內(nèi)源生物素,，尤其是在肝臟和腎臟這樣的組織。（延伸閱讀：攻克多重PCR之難）

為此,，許多研究者放棄了偶聯(lián)生物素的二抗,，開始使用一種以聚合物為基礎(chǔ)的試劑。“它們相當(dāng)于拖著一長串酶的二抗,，”Vector Laboratories公司的Craig Pow說,，該公司致力于生物試劑蛋白標(biāo)記和檢測試劑。“這顯然比使用HRP二抗要靈敏得多,。”

據(jù)Pow介紹,，這種試劑的敏感度與生物素/親和素差不多，但使用起來要簡單得多,，而且不用擔(dān)心內(nèi)源生物素產(chǎn)生的背景,。如果需要更高的敏感度，還可以采用基于多級聚合物的試劑,，比如Vector Laboratorieszui近推出的ImmPRESS™ Excel Amplified HRP Polymer Staining Kit,。

與酶體系相比，熒光體系能夠更的定位抗體,，甚至可以同時成像兩個核抗原,。不過，熒光成像的黑色背景不能提供常規(guī)顯微鏡那樣的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu),。Sigma Aldrich公司的Duolink®系統(tǒng)有足夠的敏感性和特異性,，可以通過兩個一抗檢測鄰近的抗原表位。

選擇合適的顏色

IHC中zui常用的酶是HRP和堿性磷酸酶（AP）,，不過它們的效果并非*相同,。HRP體系傾向于生成更密集的信號，“與AP相比能提供更細(xì)小更清晰的定位,，”Pow說,。但這并不是說AP就比HRP差，“實際上在某些應(yīng)用中,，正因為AP不那么稠密,，反而能展現(xiàn)出更好的形態(tài)。”

這兩種酶都有不同的生色底物,，可以產(chǎn)生不同顏色的產(chǎn)物,。“我們應(yīng)當(dāng)選擇合適的顏色和復(fù)染劑，”Crosby說。

IHC遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是把抗體放在組織切片上,，然后用顯微鏡觀察那么簡單,。要想得到實用、可靠而且清晰的結(jié)果,，就需要耐心的對每一步進行優(yōu)化,。

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