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總SOD活力檢測試劑盒I（比色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2),，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,。目前有多種SOD活性測定方法,，其中NBT（氮藍(lán)四唑）法和WST法都是常用的檢測方法,。
本試劑盒是一種基于NBT的顯色反應(yīng),，通過(Xanthine)及氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)催化產(chǎn)生超氧陰離子(O2.-),，O2.-將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲臜(formazan),，甲臜(formazan)在560 nm處有強(qiáng)吸收,。而超氧化物岐化酶（SOD）可以抑制上述反應(yīng),，從而抑制了甲臜的形成,。反應(yīng)液藍(lán)色愈深,，說明超氧化物歧化酶活性愈低,，反之則酶活性愈高。通過分析甲臜產(chǎn)物OD值,，可計(jì)算SOD酶活力,。檢測原理圖如下：

本試劑盒可以檢測細(xì)胞或組織勻漿液上清、全血,、紅細(xì)胞抽提物、血清等多種生物樣品中的SOD活性水平,。按照試劑盒提供使用步驟操作,，1個(gè)試劑盒可供100次檢測,。適合用于高通量篩選研究,。

產(chǎn)品優(yōu)勢

1）NBT法反應(yīng)產(chǎn)物是穩(wěn)定的水溶性產(chǎn)物；

2）NBT法可以通過檢測單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光值測定SOD活力,；

3）NBT法測定時(shí)最大抑制百分率可以接近100%,；

4）不受樣品中過氧化氫的干擾，本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法,，有效去除常規(guī)樣品中過氧化氫的干擾,。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸,。 -20 ℃保存,，有效期6個(gè)月,?！咀ⅰ浚篘BT溶液需避光保存,。

注意事項(xiàng)

1）待測樣品可-70 ℃保存一個(gè)月，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致SOD部分失活,；

2）細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液,，會(huì)干擾檢測,；

3）抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如0.1 mM ascorbic acid,，5 mM GSH都會(huì)使測定出來的吸光度顯著升高。如果設(shè)置了使用說明中的空白對(duì)照3,，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4）為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

5）本產(chǎn)品僅作科研用途,，禁止用于臨床診斷或治療,，禁止用于人身上,。

使用方法

1．樣品的制備

① 細(xì)胞樣品

1000-2000 g,，4℃離心10 min收集細(xì)胞,，用4℃或冰浴預(yù)冷的PBS（或生理鹽水）洗滌1-2次。用預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴中進(jìn)行勻漿沉淀（可以使用玻璃勻漿器或各類常見勻漿器,，如電動(dòng)勻漿器等）,。隨后4℃離心，取上清液待測,。

② 組織樣品

動(dòng)物解剖前用生理鹽水（0.9% NaCl，含有0.16 mg/mL肝|素||鈉）灌流*清除紅細(xì)胞,，取適量的組織樣品,。用預(yù)冷的PBS在4℃或冰浴中對(duì)組織樣品進(jìn)行勻漿處理（可以使用玻璃勻漿器或各類常見勻漿器，如電動(dòng)勻漿器等）,。 隨后4℃離心，取上清液待測,。

③ 血漿或紅細(xì)胞樣品

用抗凝管收集血液,，顛倒混勻。4℃,，600 g離心10 min，移取上清至新的1 mL離心管中,，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進(jìn)行檢測。紅細(xì)胞樣品可以參考步驟①細(xì)胞樣品的制備方法,，或其他不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。

【注】a. 上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號(hào)：20201）測定蛋白濃度,。通常10-20 µg蛋白的細(xì)胞        或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作參考),。每種樣品準(zhǔn)備20-100 µg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測,。

b. 根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品,。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液（組織和勻漿液的重量比為10%）上清,，通常需要稀釋10-100倍,。

c. 準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定,，可以冰浴保存,；如果當(dāng)天不能完成測定，于-80℃凍存可保存至少1個(gè)月,。但建議盡量當(dāng)天完成測定。注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致SOD部分失活。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作

① NBT/酶工作液的配制：

按照每個(gè)反應(yīng)160 μL的體積配置適量的NBT/酶工作液,。均勻混合158 μL SOD檢測緩沖液,、1 μL NBT和1 μL酶溶液，即可配置成160 μL NBT//酶工作液,。根據(jù)待檢測樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量，配置適量的NBT/酶工作液,。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用,，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。

【注】：由于酶溶液的用量較少且易沉降,，必須注意在使用前先輕輕離心一下,，然后適當(dāng)混勻后再使用,。

② 反應(yīng)啟動(dòng)工作液的配制

把試劑盒中的反應(yīng)啟動(dòng)液(40×) 融解后混勻,，按照每1 μL反應(yīng)啟動(dòng)液(40×)加入39 μL SOD檢測緩沖液的比例進(jìn)行稀釋,，混勻后即為反應(yīng)啟動(dòng)工作液,。根據(jù)待檢測樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)品）的數(shù)量,，配置適量的反應(yīng)啟動(dòng)工作液。配制好的反應(yīng)啟動(dòng)工作液4℃或冰浴保存,，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用,。

③ （可選）SOD標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備

需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品,，用本試劑盒提供的稀釋液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下系列濃度：200 U/mL，100 U/mL,，50 U/mL，20 U/mL,，10 U/mL，5 U/mL,，2 U/mL。在隨后的檢測中可以各取20 µL,，參考樣品進(jìn)行檢測。

【注】：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標(biāo)準(zhǔn)品需現(xiàn)配現(xiàn)用；本試劑盒對(duì)于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品,，但可以使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照或作為對(duì)SOD活性定量的參考。

3. 樣品測定

① 參考下表使用96孔板設(shè)置樣品孔和各種空白對(duì)照孔,。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻,。

【注】：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會(huì)開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差,。

【*】：如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì),，則需設(shè)置空白對(duì)照3,；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設(shè)置空白對(duì)照3,。

② 37℃孵育30 min,。 【注】：孵育25-35 min檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結(jié)果的一致性,，推薦孵育30 min。

③ 在560 nm測定吸光度,，可以選擇600 nm（或者600 nm以上，如650 nm）作為參比波長,，560 nm吸光度的值扣除參比波長的吸光度值即可作為實(shí)測讀數(shù)。
4. 樣品中總SOD活力的計(jì)算

① 抑制百分率的計(jì)算

參考如下計(jì)算公式計(jì)算抑制百分率：

抑制百分率＝[(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)－(A樣品－A空白對(duì)照3)]/(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)×100%

如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物,，則A空白對(duì)照2 = A空白對(duì)照3,，則可以把計(jì)算公式簡化為：

抑制百分率＝(A空白對(duì)照1－A樣品)/(A空白對(duì)照1－A空白對(duì)照2)×100%

【注】：盡量使樣品的抑制百分率在30%-70%范圍內(nèi)。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%,，則通常需要把該樣品重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高,，則需適當(dāng)稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低,，則需重新準(zhǔn)備濃度較高的待測樣品,。

② SOD酶活力單位的定義：在上述氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí),，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit),。

【注】：SOD活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據(jù)其定義的不同進(jìn)行適當(dāng)換算,。

③ SOD酶活力的計(jì)算

SOD酶活力的計(jì)算公式如下：

待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率) units

比如,，當(dāng)抑制百分率為50%時(shí),，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%) units＝1 units；當(dāng)抑制百分率為60%時(shí),，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%) units＝1.5 units。

④ 如果樣品為細(xì)胞或組織的勻漿液,，可以根據(jù)樣品的蛋白濃度和稀釋倍數(shù)，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白,。如果樣品為紅細(xì)胞抽提液,，可以根據(jù)血紅蛋白含量,，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

其他SOD檢測參考方案

1.SOD酶活力計(jì)算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線,，然后根據(jù)樣品檢測到的抑制百分率對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的抑制百分率曲線計(jì)算出樣品中的SOD酶活力單位,。本方案僅供參考,，使用本試劑盒時(shí)不必使用本方案進(jìn)行檢測和計(jì)算。

2.此外,，本方案需確保標(biāo)準(zhǔn)品的酶活力數(shù)據(jù)可靠，不會(huì)因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品的保存問題而導(dǎo)致實(shí)際酶活力下降,。

3.SOD酶活力的動(dòng)力學(xué)檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時(shí)也可以使用動(dòng)力學(xué)方法檢測SOD的酶活力,。通常在【步驟3 ① 后可以37 ℃孵育同時(shí)在560 nm連續(xù)測定吸光度30 min。根據(jù)30 min內(nèi)的吸光度變化的斜率計(jì)算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(斜率空白對(duì)照1－斜率空白對(duì)照2)－(斜率樣品－斜率空白對(duì)照3)]/(斜率空白對(duì)照1－斜率空白對(duì)照2)×100%

4.其余的計(jì)算方法同上述非動(dòng)力學(xué)的計(jì)算方法,。動(dòng)力學(xué)方法的檢測和計(jì)算更加精確一些，但檢測起來相對(duì)要麻煩一些,。

5.使用本試劑盒通常使用非動(dòng)力學(xué)方法即可。

HB211214