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進(jìn)行基因功能研究時(shí)，如能包含信號(hào)通路無(wú)疑會(huì)提升故事的深度和完整性,。研究信號(hào)通路很重要的一個(gè)手段是過(guò)表達(dá)基因,，觀察表型變化。今天就向大家介紹一個(gè)過(guò)表達(dá)基因的技術(shù)——過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建,。下面就從目的基因調(diào)取、引物設(shè)計(jì),、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建詳細(xì)說(shuō)明,。
以人pyrin基因、pWPI-eGFP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為例,，構(gòu)建慢病毒過(guò)表達(dá)載體pWPI-eGFP-pyrin,。
一、pyrin基因序列的調(diào)取
進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）,，
選擇pyrin種屬來(lái)源,，如人
選擇基因亞型，需查閱文獻(xiàn)（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,，并查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)pyrin亞型1與研究目的一致）
點(diǎn)擊NM 000243.2,，查找到基因pyrin的CDS區(qū)，
二,、克隆方法的選擇
n 粘性末端克隆法
該方法需要在目的基因pyrin引物的5’端加上酶切位點(diǎn),，方法如下：
1. 酶切位點(diǎn)選擇
1）pWPI-eGFP質(zhì)粒中帶有啟動(dòng)子EF-1α（與CMV啟動(dòng)子類似），雙酶切可選擇SwaⅠ與PmeⅠ或PacⅠ與PmeⅠ。注意不要選SwaⅠ與PacⅠ,，因?yàn)殡p酶切時(shí)兩個(gè)酶切位點(diǎn)的距離應(yīng)相差在9bp以上,。在這里，我們選用PacⅠ與PmeⅠ雙酶切距離說(shuō)明,。
2）雙酶切時(shí),，需要在酶切位點(diǎn)前面加上保護(hù)堿基，以保證*的酶切效率,。選取酶切效率zui高的保護(hù)堿基,。
2. pyrin基因的引物設(shè)計(jì)
以PacⅠ與PmeⅠ雙酶切為例，pyrin基因的上下游引物為
3. 設(shè)計(jì)好引物后,，PCR擴(kuò)增pyrin基因,，跑膠回收PCR產(chǎn)物，PacⅠ與PmeⅠ雙酶切pWPI質(zhì)粒和pyrin基因,，回收酶切產(chǎn)物,，連接轉(zhuǎn)化即可。
4. 挑取單克隆,，驗(yàn)證,，獲得陽(yáng)性克隆。
粘性末端克隆獲得的重組質(zhì)?？捎糜谒厕D(zhuǎn),，研究基因功能。但是,，要長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定過(guò)表達(dá)基因,，就需要慢病毒包裝，此時(shí)pWPI-eGFP中的cPPT/CTS需要保留,，那么PmeⅠ就不適合進(jìn)行酶切載體,。此時(shí)就需要另外一種克隆方法——一步法克隆。
n 一步法克隆法
該方法需要在pyrin基因引物的5’端添加與pWPI載體末端相同的重疊序列,，具體做法如下：
1. 酶切位點(diǎn)的選擇
根據(jù)慢病毒包裝的要求,，pyrin基因需要插入在cPPT/CTS位點(diǎn)前面，此時(shí)載體的線性化可以通過(guò)SwaⅠ或PacⅠ單酶切實(shí)現(xiàn),。
2. pyrin基因的引物設(shè)計(jì)
1）重疊序列大小為15-20bp,，酶切位點(diǎn)不計(jì)算在內(nèi)；2）以PacⅠ單酶切為例,，pyrin基因的上下游引物為：
3. 設(shè)計(jì)好引物后,，PCR擴(kuò)增pyrin基因，膠回收產(chǎn)物與載體酶切回收產(chǎn)物發(fā)生重組反應(yīng),。
4 挑取單克隆,，驗(yàn)證,，獲得陽(yáng)性克隆。
三,、質(zhì)粒構(gòu)建成功后,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察是否表達(dá),。若進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn),，后續(xù)還需使用該重組質(zhì)粒包裝慢病毒。
四,、注意事項(xiàng)
1,、可通過(guò)GFP蛋白的表達(dá)情況，觀察轉(zhuǎn)染效率,。若轉(zhuǎn)染效率較低,，可通過(guò)抗生素篩選，提高整合基因到基因組的細(xì)胞的純度,。因pWPI-eGFP質(zhì)粒不帶有哺乳動(dòng)物細(xì)胞藥物篩選基因,，因此可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選，獲得帶有GFP陽(yáng)性的細(xì)胞,，使整合基因到基因組的細(xì)胞純度提高,。
2、還可以通過(guò)有限稀釋法獲得單個(gè)陽(yáng)性克隆的細(xì)胞,，避免在細(xì)胞傳代過(guò)程中,，由于細(xì)胞不斷分裂，過(guò)表達(dá)的效果不斷減弱造成的表型不明顯現(xiàn)象的發(fā)生,。
3,、本案例較為特殊，對(duì)于其他過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建或慢病毒包裝而言,，一步法克隆方法與粘性末端克隆方法或許均可使用,。
HB170904
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