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不讓您寶貴的克隆留下“疤痕”,！
提起傳統(tǒng)酶切連接克隆或載體構(gòu)建，什么讓大家苦不堪言,？
小A：每次都要糾結(jié)于各種限制性內(nèi)切酶的選擇。 
小B：操作步驟繁瑣,，耗時長,，至少需三四天才能完成。
小C：每次只能克隆1個目的片段,。
小D：片段結(jié)合位置上有時會留下“疤痕”,。
······
忘記苦難，今天小編給大家介紹一種新的克隆方法—一步法同源重組技術(shù),，帶你們脫離苦惱,！
一步法同源重組是一種利用同源重組的原理，進行無縫克隆的技術(shù),。該技術(shù)無需考慮酶切位點,，幾乎適用于任何載體與任何片段的定向克隆。操作過程簡單快速,，只需50℃,，20min即可完成反應(yīng)。勁爆的是,，多個片段也可以同時克隆哦,！
激動寶寶小C：如此厲害，是如何做到呢,？
【秘】一步法同源重組的關(guān)鍵在于重組酶,。它由三種酶混合而成。分別是外切酶,，DNA聚合酶和連接酶,。
外切酶活性：該酶能沿著5’→3’方向，降解雙鏈DNA,，從而產(chǎn)生黏性末端,，這樣便于與另外的同源末端進行配對結(jié)合（兩個同源序列通過外切酶的切割，能產(chǎn)生幾乎一致的黏性末端）,。
DNA聚合酶活性：外切酶作用后,，并不能保證將每一個片段的5’末端都降解成一樣長的黏性末端，同源末端退火配對后,，極可能存在缺失的堿基,。此時需要借助DNA聚合酶進行修復(fù)缺口。
連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵,，將所有缺口補齊,，實現(xiàn)無“疤痕”拼接，即無縫克隆,。
好奇寶寶小D：外切酶降解雙鏈DNA多長呢,？是否會把雙鏈DNA切割成單鏈導(dǎo)致無法進行片段重組呢,？
莫擔心，自有妙招,！的重組反應(yīng)溫度是50℃,，遠高于外切酶的zui適溫度（37℃），此外,，外切酶的含量較低,，故重組反應(yīng)體系中很快會失去外切酶活性。對于200bp以上的雙鏈DNA-片段都是*不用擔心的,，當然,，幾十bp的小片段是不適合同源重組的。
心急寶寶小B：這么牛掰的,，快給我們講講怎么操作吧,。
步驟1：制備載體
需將線性化載體的制備好，既可以選擇酶切,，也可以選擇PCR的方式制備線性化載體,。
步驟2：設(shè)計目的片段引物
在目的片段上下游引物的5’端引入15-25bp左右載體末端同源序列。
步驟3：擴增目的片段
通過PCR的方法,，使目的片段的兩端加上了與載體末端相應(yīng)的同源序列,。
步驟4：重組反應(yīng)
按比例混合線性化載體和目的片段，50℃反應(yīng)20 min,。
步驟5：轉(zhuǎn)化,，鑒定
將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板，挑取克隆進行陽性鑒定,。
機智寶寶小A：有啥應(yīng)用呢,？
可以應(yīng)用于定點突變，CRISPR,，構(gòu)建多順反子表達載體等等,。
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