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如何構建多順反子表達載體？
隨著各種基因組測序項目的完成,，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn),，但多數(shù)基因功能不明，故研究基因的功能十分重要,。分子克隆是基因功能研究中zui為基礎和關鍵的內(nèi)容,。利用分子克隆技術將外源基因插入質(zhì)粒載體，進行外源基因的表達可能不是一件難事,。但要同時表達多個基因時,，傳統(tǒng)的方法可能就比較困難。下面給大家介紹一種多個外源基因表達的方法—構建多順反子表達載體,。
以EGFRvIII基因,、P2A多順反子元件、iRFP720基因插入到pLVX-TetOne載體中為例,，介紹如何利用傳統(tǒng)酶切酶連技術和同源重組技術進行構建多順反子表達載體,。 
酶切酶連技術
使用傳統(tǒng)酶切酶連法進行克隆時，首先需要分析酶切位點,，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)只有AgeI和BstZ17I兩個酶切位點可用于EGFRvIII基因克隆,，因為另外兩個酶切位點BamHI和EcoRI同時存在于EGFRvIII基因的內(nèi)部，導致無法使用,。而P2A元件和iRFP720基因必須和EGFRvIII基因處于同一個讀碼框,，又導致無法使用AgeI酶切位點進行后續(xù)的克隆。針對這種酶切位點無法選擇的情況,，我們可以選擇不需要考慮酶切位點的同源重組技術,。
同源重組技術
使用同源重組技術無需考慮載體的酶切位點，只需在目的片段特異性上,、下游引物5’端引入與線性化載體末端同源序列（15-25bp）即可。
1,、制備線性化載體：可以用PCR或酶切的方式得到線性化的pLVX-TetOne載體,。（膠回收純化）
2、目的基因的引物設計：EGFRvIII上游引物,、 RFP720下游引物分別與線性化的pLVX-TetOne載體具有15-25bp的同源序列,，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之間也有15-25bp的同源序列,。（這里要提到的是,，P2A元件很短，僅有66 bp,，有可能被重組酶中的外切酶*降解,。我們可以通過兩輪PCR,，在擴增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可獲得P2A + iRFP重組片段,。對于這種目的基因過短的情況,，可以采取這種方式。）
3,、目的基因的擴增：EGFRvIII,，P2A及iRFP720三個基因的擴增。（膠回收純化）
4,、重組反應：將EGFRvIII,，P2A及iRFP720三個基因同時插入到pLVX-TetOne載體中。
5,、轉(zhuǎn)化：將重組反應物轉(zhuǎn)化到克隆感受態(tài)細胞中,。
6、克隆鑒定：通過菌落PCR,，雙酶切或測序鑒定陽性克隆,。
7、表達：轉(zhuǎn)到表達感受態(tài)中進行表達,。實現(xiàn)Tet-on誘導表達EGFRvIII基因,，同時還能表達iRFP720基因，用于小動物活體熒光成像,。
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