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隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代，從傳統(tǒng)的依賴限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆,、TOPO克隆,、無縫克隆等等，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn),，為分子生物學(xué)的發(fā)展和進化提供新的力量,。
但有時候選擇多，反而讓人頭大,！
市面上常用的TOPO克隆與同源重組克隆,，到底應(yīng)該選擇哪一個克隆技術(shù)用于自己的實驗?zāi)?？今天小翌就來給各位科研er們科普一下二者之間的區(qū)別。
原理區(qū)別
TOPO克隆技術(shù)
基于拓撲異構(gòu)酶I（Topoisomerase I）的DNA克隆方法,，該酶同時具有限制性內(nèi)切酶活性和連接酶活性,，能夠識別特定DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切雙鏈DNA，使得Topo酶與3'末端形成共價鍵,。在連接反應(yīng)中,，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量,。利用該能量,，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落,，完成連接反應(yīng),。
TOPO克隆原理
目前市面上的產(chǎn)品，需根據(jù)DNA片段末端的不同,，選擇不同的TOPO克隆試劑盒,。如果高保真酶擴增片段，獲得的片段即為平末端,，可以選擇TOPO-Blunt試劑盒（翌圣Cat#10909ES,、Cat#10910ES）。如果Taq酶擴增片段,，獲得的片段即為粘性末端,，可以選擇TOPO-TA試劑盒（翌圣Cat#10907ES、Cat#10908ES）,。翌圣新一代兼容型TOPO-TA/Blunt克隆酶（Cat#10906ES）,，可以無視擴增后片段末端的區(qū)別，室溫反應(yīng)5 min即可連接上TOPO載體,，陽性克隆率接近100%,。
翌圣兼容型TOPO克隆原理
同源重組克隆技術(shù)
基于同源重組酶的定向克隆技術(shù)。首先將載體線性化,，并在插入片段正,、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列,，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的一致的序列,。PCR產(chǎn)物和線性化載體在同源重組酶（T5核酸外切酶切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶通過15-25 bp的同源序列互補配對,，Taq連接酶修復(fù)缺口）的作用下,，經(jīng)過一定的時間和溫度即可進行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆,。
同源重組原理
同源重組酶可連接單片段或者多片段,，根據(jù)插入片段數(shù)的不同,，選擇不同的一步法快速克隆試劑盒。翌圣的Hieff Clone®系列一步法克隆試劑盒,，最快僅需50℃反應(yīng)5 min即可轉(zhuǎn)化,，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上,。其中,，翌圣10911ES試劑可連接單片段，該試劑盒已發(fā)文章累計IF達到1000+,。10923ES試劑可連接1-7片段,，最長連接片段可達27 kb，是多片段連接,。值得注意的是,，同源重組技術(shù)同樣可以無視擴增后片段末端的區(qū)別,，直接進行載體,、片段連接。
翌圣單/多片段克隆連接原理
實驗步驟區(qū)別
TOPO克隆
翌圣Hieff Clone® TOPO克隆系列試劑,，僅需添加100 bp-5 kb目的片段,，室溫反應(yīng)5 min，即可完成克隆,，且無需藍白斑篩選,。
同源重組克隆
翌圣Hieff Clone®一步法克隆系列試劑，僅需添加線性化載體,、目的片段,，50℃反應(yīng)5-50 min，即可完成1-7片段的一步克隆,。
那么兩種克隆技術(shù)都是載體和片段的連接,，應(yīng)該如果選擇呢？
小翌建議大家可以根據(jù)應(yīng)用場景的不同,，選擇不同的克隆試劑盒,。
TOPO克隆
片段保存：進行長片段或復(fù)雜模板的載體構(gòu)建時，可以先將插入片段亞克隆至TOPO載體上,，將插入片段進行穩(wěn)定的保存,，方便進行后續(xù)的分子操作。
測序：對目的片段進行一代測序時,，可以將目的片段克隆至TOPO載體上,，送去測序，相對于PCR產(chǎn)物直接測序,，送質(zhì)粒測序結(jié)果更加準確,，測序更加完整,。
表達載體構(gòu)建：通過構(gòu)建表達載體在宿主細胞中表達目標基因，以研究基因的功能或生產(chǎn)特定的蛋白質(zhì),。
定點突變：在特定位置引入預(yù)定的基因序列改變,，如單個堿基的替換、插入或刪除,。用于研究基因的特定功能域,、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、疾病相關(guān)基因的研究等,。
多片段克?。?/span>同時將多個DNA片段克隆到一個載體中，構(gòu)建復(fù)雜的基因表達載體或進行基因組編輯,，用于構(gòu)建復(fù)雜的基因表達系統(tǒng),。
明星產(chǎn)品推薦
通用型TOPO克隆10906ES性能展示
平末端/粘性末端片段高效連接
浙江大學(xué)：100 bp-500 bp粘性末端連接，陽性率100%,！
某院校課題組客戶好評
通用型一步法快速克隆10923ES性能展示
1-7片段快速克隆菌落快速,、高效擴增
同濟大學(xué)：10923ES連接3片段，陽性率100%,！
克隆實驗流程 | 產(chǎn)品定位 | 名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
載體,、片段制備 | 高保真PCR | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
目的片段保存、測序 | TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
同源重組 | 1-7片段一步法定向連接,，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
轉(zhuǎn)化 | 5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 | F DH5α化學(xué)感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
菌落PCR | 快速PCR升級,，可菌P且適用復(fù)雜模板擴增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
