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隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,，分子克隆技術(shù)也隨之更新迭代,，從傳統(tǒng)的依賴(lài)限制性?xún)?nèi)切酶的方法發(fā)展到如今的TA克隆、TOPO克隆,、無(wú)縫克隆等等,，新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，為分子生物學(xué)的發(fā)展和進(jìn)化提供新的力量,。
但有時(shí)候選擇多,，反而讓人頭大,！
市面上常用的TOPO克隆與同源重組克隆,，到底應(yīng)該選擇哪一個(gè)克隆技術(shù)用于自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)?？今天小翌就?lái)給各位科研er們科普一下二者之間的區(qū)別,。
原理區(qū)別
TOPO克隆技術(shù)
基于拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topoisomerase I）的DNA克隆方法,，該酶同時(shí)具有限制性?xún)?nèi)切酶活性和連接酶活性,，能夠識(shí)別特定DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切雙鏈DNA,，使得Topo酶與3'末端形成共價(jià)鍵,。在連接反應(yīng)中,，受插入片段的5'端羥基的攻擊,，磷酸鍵釋放能量。利用該能量,，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團(tuán)連接在一起,，Topo異構(gòu)酶從載體分子上脫落，完成連接反應(yīng),。
TOPO克隆原理
目前市面上的產(chǎn)品,，需根據(jù)DNA片段末端的不同,，選擇不同的TOPO克隆試劑盒。如果高保真酶擴(kuò)增片段,，獲得的片段即為平末端,，可以選擇TOPO-Blunt試劑盒（翌圣Cat#10909ES、Cat#10910ES）,。如果Taq酶擴(kuò)增片段,，獲得的片段即為粘性末端，可以選擇TOPO-TA試劑盒（翌圣Cat#10907ES,、Cat#10908ES）,。翌圣新一代兼容型TOPO-TA/Blunt克隆酶（Cat#10906ES），可以無(wú)視擴(kuò)增后片段末端的區(qū)別,，室溫反應(yīng)5 min即可連接上TOPO載體,，陽(yáng)性克隆率接近100%。
翌圣兼容型TOPO克隆原理
同源重組克隆技術(shù)
基于同源重組酶的定向克隆技術(shù),。首先將載體線(xiàn)性化,，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線(xiàn)性化載體末端同源序列,，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線(xiàn)性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的一致的序列,。PCR產(chǎn)物和線(xiàn)性化載體在同源重組酶（T5核酸外切酶切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶通過(guò)15-25 bp的同源序列互補(bǔ)配對(duì),，Taq連接酶修復(fù)缺口）的作用下,，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間和溫度即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆,。
同源重組原理
同源重組酶可連接單片段或者多片段,，根據(jù)插入片段數(shù)的不同，選擇不同的一步法快速克隆試劑盒,。翌圣的Hieff Clone®系列一步法克隆試劑盒，最快僅需50℃反應(yīng)5 min即可轉(zhuǎn)化,，完成定向克隆,，克隆陽(yáng)性率可達(dá)95%以上。其中,，翌圣10911ES試劑可連接單片段,，該試劑盒已發(fā)文章累計(jì)IF達(dá)到1000+。10923ES試劑可連接1-7片段,，最長(zhǎng)連接片段可達(dá)27 kb,，是多片段連接。值得注意的是,，同源重組技術(shù)同樣可以無(wú)視擴(kuò)增后片段末端的區(qū)別,，直接進(jìn)行載體,、片段連接。
翌圣單/多片段克隆連接原理
實(shí)驗(yàn)步驟區(qū)別
TOPO克隆
翌圣Hieff Clone® TOPO克隆系列試劑,，僅需添加100 bp-5 kb目的片段,，室溫反應(yīng)5 min，即可完成克隆,，且無(wú)需藍(lán)白斑篩選,。
同源重組克隆
翌圣Hieff Clone®一步法克隆系列試劑，僅需添加線(xiàn)性化載體,、目的片段,，50℃反應(yīng)5-50 min，即可完成1-7片段的一步克隆,。
那么兩種克隆技術(shù)都是載體和片段的連接,，應(yīng)該如果選擇呢？
小翌建議大家可以根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景的不同,，選擇不同的克隆試劑盒,。
TOPO克隆
片段保存：進(jìn)行長(zhǎng)片段或復(fù)雜模板的載體構(gòu)建時(shí)，可以先將插入片段亞克隆至TOPO載體上,，將插入片段進(jìn)行穩(wěn)定的保存,，方便進(jìn)行后續(xù)的分子操作。
測(cè)序：對(duì)目的片段進(jìn)行一代測(cè)序時(shí),，可以將目的片段克隆至TOPO載體上,，送去測(cè)序，相對(duì)于PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,，送質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果更加準(zhǔn)確,，測(cè)序更加完整。
表達(dá)載體構(gòu)建：通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)基因,，以研究基因的功能或生產(chǎn)特定的蛋白質(zhì),。
定點(diǎn)突變：在特定位置引入預(yù)定的基因序列改變，如單個(gè)堿基的替換,、插入或刪除,。用于研究基因的特定功能域、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系,、疾病相關(guān)基因的研究等,。
多片段克隆：同時(shí)將多個(gè)DNA片段克隆到一個(gè)載體中,，構(gòu)建復(fù)雜的基因表達(dá)載體或進(jìn)行基因組編輯,，用于構(gòu)建復(fù)雜的基因表達(dá)系統(tǒng)。
明星產(chǎn)品推薦
通用型TOPO克隆10906ES性能展示
平末端/粘性末端片段高效連接
浙江大學(xué)：100 bp-500 bp粘性末端連接,，陽(yáng)性率100%,！
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1-7片段快速克隆菌落快速,、高效擴(kuò)增
同濟(jì)大學(xué)：10923ES連接3片段，陽(yáng)性率100%,！
克隆實(shí)驗(yàn)流程 | 產(chǎn)品定位 | 名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
載體,、片段制備 | 高保真PCR | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
目的片段保存、測(cè)序 | TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
同源重組 | 1-7片段一步法定向連接,，最快5分鐘完成重組反應(yīng) | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
轉(zhuǎn)化 | 5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 | F DH5α化學(xué)感受態(tài) | 11803ES80 | 10×100 μL |
菌落PCR | 快速PCR升級(jí),，可菌P且適用復(fù)雜模板擴(kuò)增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
