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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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背景介紹
已知,，生物技術(shù)藥物是指采用DNA重組技術(shù)或其他現(xiàn)代生物技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物。而蛋白質(zhì)藥物又包含多肽,、單克隆抗體,、基因工程抗體和重組疫苗等,。因此，如何表達(dá)生產(chǎn)穩(wěn)定性高,、純度好,、質(zhì)量均一的蛋白質(zhì)是這些蛋白藥物的關(guān)鍵。蛋白表達(dá)系統(tǒng)的選擇對(duì)于研發(fā)和生產(chǎn)高效蛋白質(zhì)產(chǎn)品就變得尤為重要了,，不同的表達(dá)系統(tǒng)提供了多種途徑,，以滿足對(duì)于表達(dá)水平、折疊狀態(tài),、純度和可溶性等方面的不同需求,。
目前常用的表達(dá)系統(tǒng)主要有：原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類，而原核表達(dá)系統(tǒng)中較常用的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng),，真核表達(dá)系統(tǒng)中較常用的是酵母表達(dá)系統(tǒng)（eg.釀酒酵母和畢赤酵母）,、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（eg.CHO細(xì)胞、HEK293細(xì)胞等）和昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),。其中,，昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)被認(rèn)為是具潛力的表達(dá)系統(tǒng)。
昆蟲/桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
用桿狀病毒做載體,，可高效表達(dá)外源基因,。由于其可以對(duì)真核蛋白進(jìn)行翻譯后加工等過(guò)程而被廣泛地用于真核基因的體外表達(dá)。到目前為止,，已有近千種異源蛋白在此系統(tǒng)中得到高效表達(dá),。這個(gè)表達(dá)體系的主要特點(diǎn)是可以獲得大量抗原性、免疫原性較好的,，與天然蛋白功能相似的可溶性重組蛋白,。這一特點(diǎn)優(yōu)于細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系,。由于這個(gè)載體系統(tǒng)的性質(zhì),，使其被廣泛地應(yīng)用于藥物開(kāi)發(fā)、疫苗,、促生長(zhǎng)因子,、抑癌基因蛋白產(chǎn)物、免疫活性分子和基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)領(lǐng)域的研究中,。
由于昆蟲是桿狀病毒的自然宿主,，且每種桿狀病毒都只能感染一種或幾種昆蟲，不會(huì)感染其他動(dòng)物,、植物及人類,，所以認(rèn)為在應(yīng)用桿狀病毒進(jìn)行研究時(shí)不需考慮其安全性問(wèn)題。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirus expression system,，BVES）就是以桿狀病毒作為外源基因載體,，以昆蟲細(xì)胞作為宿主進(jìn)行外源蛋白生產(chǎn)的真核表達(dá)系統(tǒng),，由轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、桿狀病毒載體和昆蟲宿主細(xì)胞系組成,。BEVS最初是為了控制農(nóng)業(yè)害蟲而在20世紀(jì)70年代開(kāi)發(fā)的,，而隨著全球疫苗市場(chǎng)的擴(kuò)張，其逐漸引起疫苗生產(chǎn)商的關(guān)注,。BVES具有易于規(guī)?；a(chǎn)、培養(yǎng)成本低,、宿主殘留對(duì)脊椎動(dòng)物的生物安全性高等優(yōu)勢(shì),，現(xiàn)已作為一個(gè)成熟的外源蛋白表達(dá)平臺(tái)，在疫苗生產(chǎn),、基因治療和其他應(yīng)用中發(fā)揮有效作用,。
常用的桿狀病毒載體包括苜蓿蠖核型多角體病毒（AcNPV）和家蠶核型多角體病毒（BmNPV），其中以AcMN-PV研究最為深入也常用,。應(yīng)用較廣的昆蟲細(xì)胞系則主要有2種：草地夜蛾細(xì)胞系（Spodopteraugerda cell line,，Sf），常用Sf21及其分離株Sf9細(xì)胞,；粉紋夜蛾細(xì)胞系（Trichoplusia ni cell line,，Tn），常用商品化的High Five™（Hi5）細(xì)胞,。其中,，Sf9細(xì)胞更適合于重組病毒擴(kuò)增及包裝，主要用于三個(gè)領(lǐng)域,，即：生產(chǎn)重組蛋白,、rAAV載體和疫苗。國(guó)際上已有Sf9細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗批準(zhǔn)上市,，另外還有一系列Sf9細(xì)胞系參與的生物制品正處于臨床試驗(yàn)階段,。
風(fēng)險(xiǎn)及法規(guī)監(jiān)管要求
桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞（Baculovirus-Sf9）表達(dá)平臺(tái)具有的優(yōu)勢(shì)，使其成為許多生物制品生產(chǎn)的有吸引力選擇,。在此情況下,，建立合適的檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)生產(chǎn)工藝，控制Sf9細(xì)胞等宿主昆蟲細(xì)胞殘留核酸限度,，以確保產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量已經(jīng)成為監(jiān)管機(jī)構(gòu)和行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點(diǎn),。
嚴(yán)格的純化工藝可以去除一部分宿主細(xì)胞DNA（HCD）等殘留雜質(zhì)成分,，但產(chǎn)品中仍然可能會(huì)有HCD殘留,，這些殘留的外源宿主細(xì)胞DNA會(huì)引發(fā)潛在的安全問(wèn)題（如潛在致瘤性、傳染性,，甚至增加免疫源性或?qū)е峦蛔儯?，所以HCD檢測(cè)項(xiàng)目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)之一,。各國(guó)的藥典法規(guī)也相繼出臺(tái)了針對(duì)生物制品中外源宿主DNA殘留量限度的規(guī)定。
《中國(guó)藥典》2020年版三部規(guī)定,，以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑外源宿主細(xì)胞DNA殘留量不能超過(guò)100pg/劑,。
《歐洲藥典》（EP10.0）通則規(guī)定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過(guò)10ng/劑。
美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布的指導(dǎo)原則中指出生物制品宿主細(xì)胞DNA殘留限度不得超過(guò)100pg/劑,，對(duì)于大劑量的生物制品（如單克隆抗體）,，根據(jù)其殘留DNA來(lái)源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10ng/劑,。
Sf9和桿狀病毒(AcNPV)殘留DNA的檢測(cè)
現(xiàn)行各國(guó)藥典中生物制品殘留DNA檢測(cè)方法主要有4種：雜交法,、閾值法、熒光染料法和定量PCR法等,。其中,，qPCR法具有的靈敏度、序列特異性和準(zhǔn)確性,，可為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質(zhì)量控制方面提供可靠的檢測(cè)手段,，現(xiàn)也已成為各生物制品企業(yè)檢測(cè)方法。
針對(duì)上述情況,，翌圣生物自主研發(fā)了Sf9和桿狀病毒（AcNPV）DNA殘留檢測(cè)試劑盒,，基于探針?lè)晒舛縋CR原理，采用多重qPCR方法分別檢測(cè)Sf9和桿狀病毒（AcNPV）殘留DNA,，Sf9定量限可達(dá)1fg/μL,，桿狀病毒（AcNPV）定量限可達(dá)7copies/uL。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒,，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器,。
產(chǎn)品資質(zhì)
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證,，符合國(guó)際機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn),；
配合審計(jì)：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計(jì)文件,；
保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn),，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定,；
技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀,，使得Kit靈敏度高；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫(kù),，雙封閉抗體提高了Kit特異性,、穩(wěn)定性等。
產(chǎn)品特點(diǎn)
抗干擾性：針對(duì)復(fù)雜基質(zhì),，樣本加標(biāo)回收率至少能達(dá)到70-130%,；
靈敏度高：定量下限(LLOQ)分別為Sf9 1fg/μL,，AcNPV 7copies/uL；
精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高CV＜10%,，批間差異小即中間精密度CV＜15%,；
專屬性強(qiáng)：特異性檢測(cè)Sf9和AcNPV殘留DNA，不受其他外源基因組DNA干擾,；
防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC),，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等,，避免假陰性,。
驗(yàn)證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，可提供完善的驗(yàn)證報(bào)告,。
驗(yàn)證內(nèi)容
| rcAAV-2檢測(cè)驗(yàn)證項(xiàng)目 | 參考標(biāo)準(zhǔn)or要求 | 備注 | |
| 1,、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品（參考品） | 含有參考基因Reference和靶基因Target的質(zhì)粒DNA | ||
| 2、線性范圍 | 標(biāo)曲范圍 | 參考說(shuō)明書或?qū)嶋H情況（Reference和Target均是2×101～2×106copies/μL） | |
| R2 | ≥0.98（P.s.本試劑盒≥0.99） | 藥典要求 | |
| 斜率 | -3.1~-3.8（P.s.本試劑盒-3.1~-3.6） | 藥典要求 | |
| 擴(kuò)增效率 | 90%~110%（P.s.對(duì)應(yīng)的斜率-3.1~-3.6,，行業(yè)內(nèi)要求） | ||
| 3,、準(zhǔn)確性 | 回收率 | 50%~150%（P.s.本試劑盒70~130%） | 藥典要求 |
| 4、精密度 | 重復(fù)性 | CV＜10% | |
| 中間精密度 | CV＜15% | ||
| 5,、專屬性 | 不受其他來(lái)源基因組DNA的干擾 | ||
| 6,、靈敏度 | 定量限 | Reference和Target均是2copies/uL | |
| 檢測(cè)限 | Reference和Target均是0.125copies/uL | ||
| 7、耐用性 | 儀器適用性 | Thermo：ABI 7500,、ABI QuantStudio5,； | |
| Bio-Rad：CFX96 Optic Module； | |||
| 上海宏石：SLAN-96S. | |||
| 8,、穩(wěn)定性 | 加速穩(wěn)定性 | 37℃穩(wěn)定14天,，2~8℃穩(wěn)定30天 | |
| 反復(fù)凍融 | ≥10次 | ||
| 有效期 | -25~-15℃保存2年 | ||
| 9、空白限 | 無(wú)模板對(duì)照（NTC） | 重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40 | |
| 陰性抽提對(duì)照（NCS） | 重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40 | ||
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預(yù)封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動(dòng)化核酸提取儀 | 48通量 |
Sf9和AcNPV殘留DNA 檢測(cè)試劑盒 | 41330ES | Sf9&AcNPV DNA Residue Detection Kit Sf9和桿狀病毒（AcNPV）DNA殘留檢測(cè)試劑盒 | 50T/100T |
