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腺相關(guān)病毒AAV簡介
早期基因治療曾嘗試腺病毒載體，但因其免疫原性過強(qiáng)和導(dǎo)入的環(huán)狀DNA可能在細(xì)胞分裂中丟失而被AAV取代,。AAV是一種無包膜單鏈DNA病毒,，屬于細(xì)小病毒家族,。AAV作為最早通過歐盟FDA認(rèn)證的基因治療載體，因其具有宿主范圍廣,、非致病性,、低免疫原性、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因,、良好的擴(kuò)散性能和物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),，已被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中。
目前已發(fā)現(xiàn)AAV有12種亞型及120多種變型,，并逐步用于基因藥物研發(fā),。rAAV攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎相同，然而衣殼內(nèi)的基因組中編碼病毒蛋白的部分被刪除，取而代之的是治療性轉(zhuǎn)基因（transgene）。
AAV基因組中被保留的部分是ITRs,，它起到指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白刪除,，一方面可以重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面可以減小病毒載體的免疫原性和細(xì)胞毒性,。
通常情況下AAV不能獨(dú)立復(fù)制,，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒,、痘苗病毒）存在時(shí)才能進(jìn)行復(fù)制,。
復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)概念及法規(guī)監(jiān)管要求
在重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體生產(chǎn)過程中,，轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA與rAAV會由于物理接近而導(dǎo)致rAAV載體基因組、Rep/Cap基因以及ITR序列發(fā)生非同源重組,，這些重組序列被誤包后就形成了具有復(fù)制能力的AAV,，即復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)。
重組腺相關(guān)病毒載體收獲液,、純化后的重組腺相關(guān)病毒原液,、終產(chǎn)品等都可能有復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的存在。rcAAV的存在可能不會引起rAAV產(chǎn)品的顯著安全性風(fēng)險(xiǎn),，但是會增強(qiáng)或干擾治療用rAAV 的作用效果或者導(dǎo)致rAAV載體基因序列的漂移 ,，影響其基因組穩(wěn)定性以及體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。因此,，規(guī)?；a(chǎn)過程中監(jiān)測和產(chǎn)品放行時(shí)檢測rcAAV十分重要。
隨著病毒載體在CGT領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛,，相關(guān)法規(guī)和技術(shù)原則對監(jiān)測復(fù)制型病毒提出了建議,。
CDE 2022年發(fā)布《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》都提到病毒載體制備工藝中,，復(fù)制型病毒是安全性風(fēng)險(xiǎn)關(guān)注點(diǎn)之一，應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的方法開展檢測,，如指示細(xì)胞培養(yǎng)法,、直接qPCR法等。
2020年11月歐洲的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)EMA也發(fā)布了指南“Guideline on quality,，non- clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells",，要求從病毒載體的設(shè)計(jì)上應(yīng)盡可能降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)降到低,，同時(shí)在產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用的不同階段進(jìn)行RCL等的控制,，以保障患者的用藥安全,。
2020年1月28日,，F(xiàn)DA發(fā)布的《關(guān)于細(xì)胞與基因治療申請(INDs)的化學(xué)、制造和控制(CMC)指導(dǎo)原則》中提到：對于復(fù)制型腺相關(guān)病毒rcAAV的檢測,，可以采用在輔助病毒存在的情況下擴(kuò)增AAV,，然后進(jìn)行PCR檢測rep/ITR序列，以及在對載體制備進(jìn)行DNase消化后進(jìn)行PCR檢測rep和cap序列等,。但該指導(dǎo)原則表明：不推薦用于檢測rcAAV的特定方法,，藥企等應(yīng)在IND中說明所用的檢測方法和檢測靈敏度。
復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的檢測
中美歐三國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測要求基本相同，在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個(gè)階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測中進(jìn)行檢測,。并且各監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測方法均是指示細(xì)胞培養(yǎng)法,，該方法是復(fù)制型病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。
復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的形成主要?dú)w因于ITR中的同源序列和相鄰序列與rep/cap元件之間可能出現(xiàn)的重組事件,。目前,，rcAAV檢測常采用2種方法：基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法和qPCR快檢法（直接檢測法）。
FDA的指導(dǎo)原則建議通過全面的質(zhì)量研究確認(rèn)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性,，由于下述rcAAV的兩種檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn),，可考慮同時(shí)采用原理互補(bǔ)的不同方法進(jìn)行研究。
基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法
通過不斷的細(xì)胞傳代使rcAAV實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增,，之后再利用qPCR或Southern-blot方法進(jìn)行檢測,，保證檢測到的rcAAV都具有復(fù)制能力，是目前常用的檢測方法,。
但是該方法也有它的缺陷：檢測靈敏度依賴于AAV不同血清型對靶細(xì)胞的感染效率,，檢測值可能低于實(shí)際值；培養(yǎng)方法和檢測平臺建立也有難度,，需建易感細(xì)胞株,、輔助病毒庫等,，耗時(shí)長且投入成本較高。
qPCR快檢法（直接檢測法）
對rAAV原液或終產(chǎn)品提取核酸后,，直接利用qPCR法檢測rcAAV,，靶標(biāo)基因一般為ITR、Rep,、Cap等的連接序列,，可實(shí)現(xiàn)對rcAAV上兩種基因的檢測，提高準(zhǔn)確性,。
其缺點(diǎn)為：檢測片段短,，不能保證檢測目標(biāo)具備rcAAV復(fù)制所需完整序列，導(dǎo)致檢出的rcAAV不一定有復(fù)制能力,，檢測值相較實(shí)際值偏高,。
因此，針對rcAAV的檢測開發(fā)一款既能用于細(xì)胞培養(yǎng)后的終點(diǎn)檢測,，也能用于rcAAV直接檢測的qPCR試劑盒,，對于實(shí)現(xiàn)兩種檢測方法的互補(bǔ)驗(yàn)證非常有必要。
針對上述情況,，翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒,，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法分別檢測rAAV末端重復(fù)序列(ITR)（即參考基因Reference）和rcAAV的連接序列（即靶基因Target）,，實(shí)現(xiàn)對rAAV和rcAAV的同時(shí)定量檢測,。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動(dòng)化核酸提取儀器,。用于定量分析檢測各種使用AAV2血清型的重組腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行基因治療,、腫瘤治療及疫苗研發(fā)等產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
產(chǎn)品資質(zhì)
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證,，符合國際機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn),；
配合審計(jì)：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計(jì)文件,；
保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn),，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定,；
技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀,，使得Kit靈敏度高；
專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性,、穩(wěn)定性等,。
產(chǎn)品特點(diǎn)
抗干擾性：針對復(fù)雜基質(zhì)，樣本加標(biāo)回收率至少能達(dá)到70-130%,；
靈敏度高：定量下限(LLOQ)為2copies/μL,，檢測下限(LLOD)為0.125copies/μL；
精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高CV＜10%,，批間差異小即中間精密度CV＜15%,；
專屬性強(qiáng)：特異性檢測目的基因序列，不受其他外源基因組DNA干擾,；
防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC),，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等,，避免假陰性,。
驗(yàn)證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,，可提供完善的驗(yàn)證報(bào)告。
驗(yàn)證內(nèi)容
rcAAV-2檢測驗(yàn)證項(xiàng)目 | 參考標(biāo)準(zhǔn)or要求 | 備注 | |
1、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品（參考品） | 含有參考基因Reference和靶基因Target的質(zhì)粒DNA | ||
2,、線性范圍 | 標(biāo)曲范圍 | 參考說明書或?qū)嶋H情況（Reference和Target均是2×101～2×106copies/μL） | |
R2 | ≥0.98（P.s.本試劑盒≥0.99） | 藥典要求 | |
斜率 | -3.1~-3.8（P.s.本試劑盒-3.1~-3.6） | 藥典要求 | |
擴(kuò)增效率 | 90%~110%（P.s.對應(yīng)的斜率-3.1~-3.6，行業(yè)內(nèi)要求） | ||
3,、準(zhǔn)確性 | 回收率 | 50%~150%（P.s.本試劑盒70~130%） | 藥典要求 |
4,、精密度 | 重復(fù)性 | CV＜10% | |
中間精密度 | CV＜15% | ||
5、專屬性 | 不受其他來源基因組DNA的干擾 | ||
6,、靈敏度 | 定量限 | Reference和Target均是2copies/uL | |
檢測限 | Reference和Target均是0.125copies/uL | ||
7,、耐用性 | 儀器適用性 | Thermo：ABI 7500、ABI QuantStudio5,； Bio-Rad：CFX96 Optic Module,； 上海宏石：SLAN-96S. | |
8、穩(wěn)定性 | 加速穩(wěn)定性 | 37℃穩(wěn)定14天,，2~8℃穩(wěn)定30天 | |
反復(fù)凍融 | ≥10次 | ||
有效期 | -25~-15℃保存2年 | ||
9,、空白限 | 無模板對照（NTC） | 重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40 | |
陰性抽提對照（NCS） | 重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40 | ||
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品 | 貨號 | 品名 | 規(guī)格 |
樣本前處理 試劑盒 | 18461ES | MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） | 25T/100T |
18467ES | MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預(yù)封裝) | 3×16T/ 6×16T | |
核酸提取儀器 | 80511ES | 48通道自動(dòng)化核酸提取儀 | 48通量 |
rcAAV-2檢測試劑盒 | 41327ES | Replication-competent AAV Serotype 2 (rcAAV2) Detection Kit 復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒 | 50T/100T |
