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要問DNA-蛋白質(zhì)互作技術(shù)誰最火,？就不得不提CUT&Tag技術(shù)了！CUT&Tag技術(shù)自2019年問世以來,，不斷突破創(chuàng)新,，從最初只能做組蛋白修飾，到現(xiàn)在越來越多轉(zhuǎn)錄因子見刊,，甚至各種R-loop,、G4結(jié)構(gòu)的研究也被大量報(bào)道。更不要說單細(xì)胞技術(shù)爆火的現(xiàn)在,，scCUT&Tag技術(shù)中,，各種動物、細(xì)胞以及植物的文章見刊,，并且CUT&Tag技術(shù)還衍生出了多靶標(biāo)CUT&Tag,，實(shí)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞，多個(gè)靶標(biāo)的研究,。
2021年 大量轉(zhuǎn)錄因子研究見刊
2021年1月 scCUT&tag在動物應(yīng)用方向研究見刊
2022年12月 nano-CUT&Tag推出
更多應(yīng)用持續(xù)更新……
最近經(jīng)常聽到單細(xì)胞ChIP技術(shù)，小翌立馬查閱資料去一探究竟,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還是換湯不換藥,，這個(gè)單細(xì)胞ChIP技術(shù)不就是咱們scCUT&Tag么？
為了幫助大家提升CUT&Tag實(shí)驗(yàn)技能,，小翌整理了之前的一些CUT&Tag知識,，同時(shí)將CUT&Tag實(shí)驗(yàn)的甲醛交聯(lián)方案和CUT&Tag-qPCR方案一起匯總，希望大家進(jìn)一步提升CUT&Tag技能,，后續(xù)如果也想嘗試單細(xì)胞ChIP,，或者是已經(jīng)在做單細(xì)胞ChIP，咱們也能更得心應(yīng)手,。
CUT&Tag甲醛交聯(lián)方案
【注】
A：在CUT&Tag實(shí)驗(yàn)開始前,，我們需要確定實(shí)驗(yàn)方案。隨著CUT&Tag技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)有些目標(biāo)蛋白質(zhì)在研究時(shí),，輕微甲醛交聯(lián)效果更好,。之后，更多的研究表明,，使用CUT&Tag技術(shù)研究不同蛋白時(shí),，所需的實(shí)驗(yàn)條件也不一樣。做組蛋白修飾,、強(qiáng)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(如CTCF,、RNA polll等)無需甲醛交聯(lián)。而一些弱結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄輔因子則需要甲醛交聯(lián),，并且甲醛交聯(lián)的強(qiáng)度也不一樣,。常規(guī)的輕微甲醛交聯(lián)條件為0.1%甲醛室溫交聯(lián)2 min，之后用0.1 M甘氨酸終止交聯(lián),。
B：若在實(shí)驗(yàn)時(shí),，有添加甲醛進(jìn)行輕微交聯(lián)，那么后續(xù)加終止buffer后,，步驟稍微有調(diào)整哦,！甲醛交聯(lián)后，蛋白酶K消化步驟調(diào)整為：向每個(gè)樣品中加入2 μL 15× Terminate Solution,、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K（此時(shí)磁珠會板結(jié)）（若樣品較多,，可一起提前配制）。全速渦旋樣品約10 sec,，混勻后瞬離,，將樣品置于PCR儀，55 oC消化2 h (熱蓋不低于70 oC)或者37 oC過夜,。
CUT&Tag-qPCR方案
qPCR 定量檢測
反應(yīng)體系（推薦冰上配制）
反應(yīng)程序
【注】
快速程序適用于絕大多數(shù)基因,，個(gè)別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試標(biāo)準(zhǔn)程序。
a) 退火溫度和時(shí)間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進(jìn)行調(diào)整,。
b) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置,，幾種常見儀器的時(shí)間設(shè)定如下：
20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec：Applied Biosystems 7300
32 sec：Applied Biosystems 7500
c) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序。
結(jié)果分析
圖:使用試劑盒中的spikein 3進(jìn)行normalization處理,，同一基因在不同投入量細(xì)胞結(jié)果中,基因的富集倍率差異不大。
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