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基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)應(yīng)用——3D培養(yǎng)

2022-7-20　　閱讀(392)

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傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)是在單層中生長(zhǎng),，細(xì)胞是扁平并可以在水平面上自由粘附和擴(kuò)散，但不支持在垂直方向上擴(kuò)散,，2D表面上培養(yǎng)的細(xì)胞具有強(qiáng)烈的頂端-基底極性,，這種極性與某些細(xì)胞類(lèi)型相關(guān)，例如上皮細(xì)胞,；3D細(xì)胞培養(yǎng)即三維細(xì)胞培養(yǎng),，是指將具有三維結(jié)構(gòu)的不同材料載體與各種細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，使細(xì)胞在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移,、生長(zhǎng),，形成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合體，主要用于細(xì)胞球,、類(lèi)器官等培養(yǎng)。





圖1.在 ECM 涂層玻璃或塑料表面 (2D) 與典型的 3D ECM 之間區(qū)別[1]


作為疾病驗(yàn)證模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型,，以3D為基礎(chǔ)培養(yǎng)的類(lèi)器官在闡明疾病的發(fā)展,、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機(jī)理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，在多領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要,，諸如細(xì)胞治療,、藥物研發(fā)、基因工程,、免疫研究,、組織再生等領(lǐng)域，基質(zhì)膠作為類(lèi)器官和3D培養(yǎng)的重要載體,，在其中發(fā)揮著舉足輕重的作用,。


表1.2D和3D培養(yǎng)對(duì)比[1]


基質(zhì)膠是從富含胞外基質(zhì)蛋白EHS小鼠腫瘤中提取出的可溶性基底膜制備物，其主要成分由層粘連蛋白,，Ⅳ型膠原,，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長(zhǎng)因子如TGF-beta,、EGF,、IGF、FGF,、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長(zhǎng)因子,。為組織和細(xì)胞提供支撐、抗拉強(qiáng)度和支架支撐,，也可以作為細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)的三維亞結(jié)構(gòu)以及生長(zhǎng)因子,、趨化因子和細(xì)胞因子的儲(chǔ)存庫(kù)，同時(shí)可作為細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和分化的信號(hào)等,。翌圣生物開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的CeturegelTM基質(zhì)膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）,，超低內(nèi)毒素含量，并全部經(jīng)過(guò)支原體檢測(cè)保證無(wú)支原體污染,，包括基本濃度,、高濃度、低生長(zhǎng)因子等不同類(lèi)型基質(zhì)膠,。



應(yīng)用方向



產(chǎn)品特點(diǎn)


安全性高：不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）
濃度多樣性：濃度范圍在8~20 mg/mL之間
批次穩(wěn)定性好：嚴(yán)格生產(chǎn)質(zhì)檢過(guò)程保證批次間性能穩(wěn)定
低內(nèi)毒素：內(nèi)毒素含量≤4 EU/mL
污染物檢測(cè)： 經(jīng)檢測(cè)無(wú)支原體和細(xì)菌,、真菌殘留
單批產(chǎn)量高：?jiǎn)闻a(chǎn)量在L級(jí)別以上
兼容性好：可與任何類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)基兼容



3D培養(yǎng)驗(yàn)證


制備細(xì)胞懸液


將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液槍頭置于冰上預(yù)冷,，基質(zhì)膠置于冰上或4℃緩融,，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，使用PBS輕柔潤(rùn)洗并用胰蛋白酶消化細(xì)胞,。終止消化后制備并收集單細(xì)胞懸液,，1500 rpm離心3min,，棄上清并用DMEM*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞后,，用調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)細(xì)胞/mL,。


細(xì)胞接種


取緩融后的基質(zhì)膠和調(diào)整好濃度的單細(xì)胞懸液1:1冰上輕輕混勻，用預(yù)冷的200μL移液槍頭取40~50μL上述混勻單細(xì)胞懸液垂直滴于預(yù)冷24孔板中,，使其形成拱型細(xì)胞液滴,。


結(jié)果統(tǒng)計(jì)


于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)穩(wěn)定30min后,，每孔加入1~2mL DMEM*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),，每天觀察并拍照記錄。


圖2.細(xì)胞3D培養(yǎng)4d后結(jié)果



FAQ


01 拿到的基質(zhì)有色差的變化（淡黃色到深紅色）是什么原因,？

對(duì)于含酚紅的基質(zhì)膠主要原因是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2作用引起的,，但是與5％CO2平衡后色差即會(huì)減少。凍融后,，輕輕搖晃試劑瓶使基質(zhì)膠分散均勻,。


02 基質(zhì)膠的操作要注意哪些事項(xiàng)？

所有操作需在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行,，應(yīng)使用預(yù)冷的移液器以保證基質(zhì)膠呈勻漿狀,。


03 基質(zhì)膠的如何分裝凍存使用？

可將凍融后的CeturegelTM基質(zhì)膠分裝在多個(gè)小管,，所有分裝均需用預(yù)冷的凍存管,，迅速冷凍并保存，避免多次凍融,。所有涉及到使用的物品在使用前需預(yù)冷,，使用預(yù)冷的移液管、吸頭及小管等操作基質(zhì)膠,。


[1] Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 2012 Jul 1;125(Pt 13):3015-24. doi: 10.1242/jcs.079509. Epub 2012 Jul 13. PMID: 22797912; PMCID: PMC3434846.



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