上海橋星生物

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一,、胰蛋白酶（trypsin）溶液

    胰蛋白酶是白色或淡黃色粉末,，低溫干燥保存。主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解,，使細胞離散,。其活性以其消化酪蛋白的能力進行測定,。常用1:250（1:500）方法表示，即1份胰蛋白酶可以消化250份（或500份）酪蛋白,。

胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的性質(zhì)關(guān)系密切,。不同細胞系對胰蛋白酶溶液的濃度、溫度和作用時間等的要求也不相同,。

    無鈣鎂離子的平衡鹽溶液（常用于配制胰蛋白酶溶液或用于洗滌細胞）

    NaCl    8g

    KCl    0.20g

    KH2PO4    0.02g

    Na2HPO4    0.073g

    葡萄糖    2.00g

    酚紅    0.02g

    溶于1000ml水中

    染色體的G帶核型實驗中胰蛋白酶用生理鹽水配制,。

二、EDTA溶液

    又稱versene,，一般用其鈉鹽,，因可溶性較好。有些組織需要Ca2+,、Mg2+來保持其完整性,，用EDTA來排除這些離子，可使細胞之間裂解,，以分散細胞,。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%,，以無鈣,、鎂的平衡鹽溶液配制。

    實驗室內(nèi)常將胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合使用,?？商岣呦剩毎稚⑶闆r改善,。

EDTA不能被血清抑制,，所以消化后必須*清洗。

EDTA對成纖維細胞作用差,。

三,、膠原酶溶液

    1．用Hank's液配制成2000U/ml

    2．36.5度攪拌溶解1h，4度過YE

    3．濾過消毒

    4．分裝成等份使用（1-2周內(nèi)）

    5．長時間貯存在-20度

四,、貼壁細胞——消化法——細胞懸液

    1．吸除或倒掉瓶內(nèi)培養(yǎng)液,。

    2．以25cm2培養(yǎng)瓶為例,，向瓶內(nèi)加入1ml消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶,，使消化液流遍所有細胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1ml消化液,，輕輕搖動后再倒掉大部分消化液,，僅留少許進行消化。也可不采用上述步驟,，直接加1-2ml消化液進行消化,，但要注意盡量減少消化液的剩余量，因為消化液過多對細胞有損傷，同時也需要較多的含血清培養(yǎng)液去中和,。

    3．消化在37度或室溫25度環(huán)境下進行,。消化2-5分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮,、細胞間隙增大后,，應立即終止消化。

    4．如僅用胰蛋白酶可直接加含血清的培養(yǎng)液,，終止消化,。

       如用EDTA消化，需加Hank's液數(shù)毫升,，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶把殘留EDTA消化液沖掉,，然后再加培養(yǎng)液，這個操作過程要十分小心,，如果細胞已經(jīng)脫壁則消化液不能夠倒掉,，以免丟失細胞，要加入Hank's液或培養(yǎng)液終止消化,，吹打收集細胞懸液,，離心漂洗去除EDTA。

    5．用彎頭吸管,，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,，反復吹打瓶壁細胞，吹打過程要順序進行,，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束,，以確保所有底部都被吹到。吹打時動作要輕柔不要用力過猛,，同時盡量不要出現(xiàn)泡沫,，這些都對細胞有損傷。細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液,。