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一、實驗原理
變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據(jù)DN段的熔解性質(zhì)而使之分離的凝膠系統(tǒng),。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性,。核酸50%發(fā)生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）。Tm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少,。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50~60 ℃,，變性劑0~100%。當一雙鏈DN段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時,，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當于此段DNA的低熔點區(qū)的Tm值,，此區(qū)便開始熔解,，而高熔點區(qū)仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發(fā)生改變,，達到分離的效果,。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低,。因此,，DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變,。
為了提高DGGE的突變檢出率,，可以人為地加入一個高熔點區(qū)——GC夾,。GC夾（GC clamp）就是在一側引物的5′端加上一個30~40bp的GC結構，這樣在PCR產(chǎn)物的一側可產(chǎn)生一個高熔點區(qū),，使相應的感興趣的序列處于低熔點區(qū)而便于分析,。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%,。
作為一種突變檢測技術,，DGGE具有如下的優(yōu)點：（1）突變檢出率高,。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達1kb,，尤其適用于100~500bp的片段。（3）非同位素性,。DGGE不需同位素摻入,，可避免同位素污染及對人體造成的傷害,。（4）操作簡便、快速,。DGGE一般在24小時內(nèi)即可獲得結果,。（5）重復性好,。但是,，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴,。
二,、實驗用品
1．PCR擴增儀,；變性梯度凝膠電泳儀；凝膠成像及分析系統(tǒng),；紫外透射儀,；高速離心機；電泳儀,；電泳槽,。
2．尿素,、去離子甲酰胺,、丙烯酰胺,、甲叉雙丙烯酰胺,、瓊脂糖
3．微量加樣器（200μl，20μl）,；Tip頭（200μl，20μl）,。Tip頭盒（200μl,，20μl）；Eppendorf管（0.5ml,，0.2ml），Eppendorf管架,。
4．PCR擴增相關試劑
三、實驗步驟
1．PCR反應（同前）
其中,，上游引物加40bp [GC] Clamp,。
2．PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認,。
3．垂直變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直,。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0～100%,。其中,，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性,。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的zui適解鏈條件（即變性濃度）。
PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣,，300～400μl/孔，電壓150V,，溫度60℃,，時間2～4小時,。
4．平行變性梯度凝膠電泳
變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據(jù)垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區(qū)域的變性濃度,，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠,，檢測各標本是否存在突變。
PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后,，25μl～30μl/孔，電壓150V,，溫度60℃，時間3～6小時,。
5．染色5分鐘,，凝膠成像儀分析結果。
四,、注意事項
1、該實驗中提取DNA,，以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒,，還有致癌、變性等毒害,，一定要嚴格操作,，做好防護保護自己,。
2、嚴格按操作步驟,。
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