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實(shí)驗(yàn)試劑
液氮,，干冰,，1％明膠，4％多聚甲醛,，PBS,，含1％NP-40的PBS，3％BSA／PBS稀釋抗體,，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,，DAB／金屬鹽試劑，3％過氧化氫,，0.3％(W／V)氯化鎳貯存液,，Harris蘇木精，乙醇
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
載玻片,，Whatman 1＃濾紙,，低倍光學(xué)顯微鏡
實(shí)驗(yàn)材料
未受損傷的組織
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將未受損傷的組織切剖成小樣本，約lcmXIcmX0.4cm,。
2. 將標(biāo)本放在卡片的一端,。標(biāo)記該卡片，將帶有標(biāo)本的一端浸入液氮中,。60s后,，取出標(biāo)本并放在干冰上,。修剪卡片，使其大小剛好比組織塊稍大些,，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的(-70℃)帶有標(biāo)記的小瓶中,。
3. 切片前，用1％明膠包被潔凈的載玻片,。加熱至50℃使明膠溶于水中,，冷卻，加入0.02％疊氮鈉,。將玻片浸入明膠溶液中30s,，取出，自然干燥,。
4. 按照儀器使用說明書,，用低溫恒溫器制備冷凍切片。通常切片厚度在5-10gm之間,。用包被過的載玻片收集切片,。
5. 讓切片自然干燥。浸入新鮮配制的4％多聚甲醛中2min,。
6. 用PBS洗數(shù)次,，放入含1％NP-40的PBS中5rain。用PBS洗數(shù)次,。
7. 將帶有組織切片的載玻片放在濕盒中,。加合適稀釋度的一抗，用含蛋白質(zhì)的溶液如3％BSA／PBS稀釋抗體,。
單克隆抗體選用雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(特異性抗體濃度為20-50gg／m1),。小鼠腹水、純化的單克隆抗體和多克隆抗體,，以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)該測試其稀釋度,，以使特異性抗體的濃度在0.1～10ug／m1之間。如果特異性抗體的濃度是未知的,，則制備并測試初始制品的不同稀釋度(1：10,，1：100，1：1000和1：10 000),。
8. 將玻片置濕盒中于室溫下孵育至少60min,。對于某些反應(yīng)來說，孵育時(shí)間可延長至24h,，以增加其敏感性,。
9. 用PBS洗3次，每次5min以上,。
10. 加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(特異性針對一抗),。這些試劑可以購自不同的經(jīng)銷商,。如果二抗的確切用量是未知的，測試1：50—1：1000稀釋的二抗,。用含蛋白質(zhì)的PBS稀釋,，如3％BSA／PBS,。
11. 將樣本置濕盒中,，于室溫下孵育30min。
12. 用PBS洗3次,，每次5min以上,。
13. 配制DAB／金屬鹽試劑。將6mg DAB溶于9ml 0.05mol／L Tris緩沖液(pH7.6)中,。加lm[0.3％(W／V)氯化鎳貯存液(可用相同濃度的氯化鈷代替),。加0.1ml 3％過氧化氫。如果出現(xiàn)沉淀,，用Whatman 1＃濾紙(或相似品)過濾,。
14. 將上述溶液加到標(biāo)本中。在低倍光學(xué)顯微鏡下觀察,。當(dāng)形成足夠的棕／黑色沉淀時(shí),，用水沖洗以終止反應(yīng)。通常這一反應(yīng)過程約需1-20min,。
15. 加數(shù)滴Harris蘇木精,。孵育約5min。時(shí)間長短取決于染色的強(qiáng)度,。
16. 用水輕柔沖洗,。
17. 通過各級乙醇使標(biāo)本依次脫水。在75％乙醇中孵育兩次,，每次3min,，95％乙醇中2次，每次3min,，100％乙醇中2次,，每次3min。自然干燥,。
18. 加一小滴DPX至標(biāo)本上,。小心在其上面放一蓋玻片(1＃) 避免產(chǎn)生氣泡。用紙巾去除多余的液體,。DPX很快可以凝固,，樣品便可觀察并照相。
