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實驗原理
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),，將抗原,、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù),。由于抗原,、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,，每加入一種試劑孵育后,，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中,，通過不同的設(shè)計,，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法(圖a),、用于檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等,。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
實驗試劑
1. 試劑
1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):
Na?CO３ 1.59克
NaHCO３ 2.93克
加蒸餾水至1000ml
2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO４·12H2O 2.9克
NaCl 8.0克
KCl 0.2克
Tween-20 0.05％ 0.5ml
加蒸餾水至1000ml
3) 稀釋液：
牛血清白蛋白(BSA) 0.1克
加洗滌緩沖液至100ml
或以羊血清,、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用,。
4) 終止液(2M H２SO４）：
蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml,。
5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):
0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml
0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml
加蒸餾水50ml,。
6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:
TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml
底物緩沖液(PH5.5) 10ml
0.75％H２O２ 32μl
7) ABTS使用液:
ABTS 0.5mg
底物緩沖液(PH5.5) 1ml
3％H２O２ 2μl
8) 抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體,。
9) 正常人血清和陽性對照血清,。
實驗設(shè)備
聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀,，50μl及100μl加樣器,，塑料滴頭，小毛巾,，洗滌瓶,。
小燒杯、玻璃棒,、試管,、吸管和量筒等。
4℃冰箱,，37℃孵育箱,。
實驗步驟
方法一 用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃過,。次日，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次,，每次3分鐘。(簡稱洗滌,，下同),。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃孵育1小時。然后洗滌,。(同時做空白孔,，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml,。37℃孵育0.5～1小時，洗滌,。
4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml,。
6. 結(jié)果判定：可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng),，陰性反應(yīng)為無色或極淺,，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ ",、“-"號表示,。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色,，則410nm)處,，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,，即為陽性,。
方法二 用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml,，4℃過,。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌,。(同時做空白,、陰性及陽性孔對照)
↓
于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,，
37℃孵育30-60分鐘,，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。
↓
其余步驟同“雙抗體夾心法"的4,、5、6,。
注意事項
1. 正式試驗時,，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,。有時本底較高,，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清,、兔血清或BSA等封閉,。
2. 在ELISA中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的,，其中包括:
1) 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體,，如聚氯乙烯、聚苯乙烯,、聚丙酰胺和纖維素等,。其形式可以是凹孔平板、試管,、珠粒等,。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被,，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,，據(jù)此判明其吸附性能是否良好,。
2) 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間,。吸附溫度,，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1,、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后,，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值,。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度,。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。
3) 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份),。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物,、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
4) 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉,、安全,、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,，應(yīng)注意防護(hù),。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體,。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng),。通常底物作用時間,，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,，尤其是H2O2在臨用前加入,。
