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實驗試劑
1. 5x樣品緩沖液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS,，0.5ml巰基乙醇,，1ml 1％溴酚藍(lán)，0.9ml蒸餾水,?？稍?℃保存數(shù)周，或在－20℃保存數(shù)月,。
2. 凝膠貯液：在通風(fēng)櫥中,，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g,，加重蒸水溶解后,，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中,，4℃保存,，一般可放置1個月。
3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ,，加1mol/L HCl 48ml,，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH8.9,，定容至100ml,， 4℃保存。
4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ,，加1mol/L HCl 48ml,，加重蒸水80ml使其溶解，調(diào)pH6.7,，定容至100ml,， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris 6.0g,，甘氨酸28.8g,，加蒸餾水約900ml,，調(diào)pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml,。置4℃保存,，臨用前稀釋10倍。
8. 考馬斯亮藍(lán)G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G250,，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70％的過氯酸,，zui后補足水到250ml,，攪拌1小時，小孔濾紙過濾,。
實驗設(shè)備
電泳儀,，電泳槽，水浴鍋,，搖床,。
實驗步驟
1. 樣品制備
將蛋白質(zhì)樣品與5X樣品緩沖液（20ul＋5ul）在一個Eppendorf管中混合。放入100℃加熱5－10min,，取上清點樣,。
2. 分離膠及濃縮膠的制備
1) 將玻璃板、樣品梳,、Spacer用洗滌劑洗凈,，用ddH2O沖洗數(shù)次，再用乙醇擦拭,，晾干,；
2) 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ說明書提示裝好玻璃板,；
3) 按如下體積配制10％分離膠8.0 ml,，混勻；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4) 向玻璃板間灌制分離膠,，立即覆一層重蒸水,，大約20 min后膠即可聚合；
5) 按如下體積配制6％濃縮膠3.0 ml,，混勻,；ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6) 將上層重蒸水傾去，濾紙吸干,，灌制濃縮膠,，插入樣品梳；
7) 裝好電泳系統(tǒng),，加入電極緩沖液,，上樣20 μl;
8) 穩(wěn)壓200V,，溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時，停止電泳,，約需45 min～1hr.
9) 卸下膠板,，剝離膠放入染色液中，室溫染色1～2 hr,；加入脫色液,，置于80 rpm脫色搖床上,每20 min更換一次脫色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇,；45 ml蒸餾水）至*脫凈,。
