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實(shí)驗(yàn)原理

若將可溶性的鼻疽抗原吸附在比其體積大千萬(wàn)倍的紅細(xì)胞表面上,，使紅細(xì)胞產(chǎn)生一種新的血清學(xué)性質(zhì)，制成所謂的致敏紅細(xì)胞,，即可用以診斷鼻疽。只要與少量相應(yīng)抗體相遇,，紅細(xì)胞通過(guò)抗原抗體反應(yīng),，即可被動(dòng)地結(jié)合在一起，呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象,，陰性者紅細(xì)胞由于自然沉積于孔底,，則呈圓點(diǎn)狀。這樣可以明顯地提高反應(yīng)的敏感性,。

間接血凝試驗(yàn)即間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn),，它也存在一些缺點(diǎn)，例如不同批次制備的抗原或紅細(xì)胞,，在敏感性和穩(wěn)定性方面,，可能不一致，它很容易受外界因素的影響,，發(fā)生非特異性凝集,，所以應(yīng)用的器皿等就應(yīng)當(dāng)清潔，不要有污物或雜質(zhì)等,，遇到非特異凝集時(shí),，要做間接凝集抑制試驗(yàn)(indirect hemagglutination inhibition test)，以排除非特異性反應(yīng),。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的配制：

   甲液：Na₂HPO₄ 21.3 g (或Na₂HPO₄?12H₂O 53.72 g) NaCl 8.5 g

   乙液：KH₂PO₄ 20.42 g NaCl 8.5 g

上述甲,、乙液配方各加蒸餾水至1000ml，溶解后,，過(guò)濾,，分別保存。使用時(shí),，將甲,、乙液混合，再加等量的蒸餾水即配成0.15mol/L不同pH值的PBS,，搖勻滅菌備用,。

   pH值甲液：0.15mol/L Na₂HPO₄、NaCl

   乙液：0.15mol/L KH₂PO₄ NaCl

2. 1%兔血清緩沖鹽水的配制：將新分離的兔血清56℃ 30min滅活后,，取所需量(如10ml)加約半量(如0.5ml)的洗過(guò)的壓積綿羊紅細(xì)胞,，并加兔血清量4倍(如4ml)的pH值7.2 PBS，置37℃水浴箱中作用10min,，以吸收兔血清中的異嗜性凝集素,，1500 r/min離心10min,，吸取上清，加pH值7.2 PBS 9.5ml,，即為1%兔血清PBS液,，置4℃冰箱中，可保存2天,。

3. 阿氏液(Alsever’s solution)的配制：按以下配方配制,，調(diào)正pH值6.1，過(guò)濾后分裝小瓶,，以113℃高壓蒸氣滅菌15min后,，置4℃冰箱中備用。

   枸櫞酸鈉(Na₃C₆H₅O₇?5H₂O)0.8 g

   葡萄糖2.05 g

   枸櫞酸0.0325 g

   氯化鈉0.42 g

蒸餾水加至100 ml

4. 紅細(xì)胞：無(wú)菌采取綿羊血液于阿氏液中,，于4℃冰箱中保存,，可供3周內(nèi)使用。

5. 固定劑：25%戊二醛溶液,。

6. 鞣酸溶液：所用鞣酸必須是純品,，用前用雙餾水配成1/200溶液(使用時(shí)，再用pH值7.2 PBS配成所需濃度),，放4℃冰箱中保存,，可供一周內(nèi)使用。

7. 鼻疽抗原及被檢馬血清(56℃ 30min滅活),。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 血清反應(yīng)板：為有機(jī)玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)制成,，目前常用的為96孔板，長(zhǎng)132cm,，寬84cm,，厚12cm。板孔的形狀基本有兩種,，即尖底的(V形)和圓底的(U形),，其中V形板可供血凝試驗(yàn)用，它較U形板具有更典型的凝集終點(diǎn),；U形板用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)較好,。96孔V形板的孔徑為0.6cm，每孔的總?cè)萘繛?.25ml,。

用過(guò)的血清板，可以0.1%新潔爾滅,、3%～5%次亞氯酸鈉或5%甲醛溶液浸泡1～2h,，或用紫外線(xiàn)消毒，但不能用來(lái)蘇兒,，因它可使血清板變色,，如為無(wú)傳染性的被檢材料,，可直接用清水沖洗3～4次后，晾干備用,。由于血清板的硬度不夠,，容易擦毛，所以洗擦?xí)r,，可用紗布輕抹,，不能用手指或硬布擦表面，以免發(fā)毛,。清洗時(shí),，水溫不能超過(guò)90℃，以免變形,。

2. 微量滴管：國(guó)內(nèi)尚無(wú)定型產(chǎn)品,，可自行加工。所用玻璃滴管長(zhǎng)約20cm,，于1/4處有一球形膨大部,，下端接針頭處為磨口的，把16G號(hào)針頭磨平(即將針尖適當(dāng)磨鈍,，以調(diào)正液滴大小,，使每毫升恰為40滴)，使每滴量為0.025ml,，上端接小乳頭,。加液時(shí)，要使滴管與血清板成垂直位置,，以盡量使每滴液體的量相同,。

3. 稀釋棒：金屬制品。全長(zhǎng)約20cm,，頭部為合金鋼制成,，呈灰白色(氧化的金屬)，表面微粗糙些,，以達(dá)到有效地吸取液體和吸取液體的一致性,，為了長(zhǎng)期保持棒頭的氧化層，吸取的即便不是帶菌的液體,，每使用20次,，棒頭也應(yīng)過(guò)火一次，可燒至暗紅色,，但不能燒至鮮紅,。棒頭能蘸吸、移液和混合液體,，能吸取液體是由于毛細(xì)管的作用和表面的粘附作用,。目前國(guó)內(nèi)制造的棒頭上有8條縱溝,，吸液量為0.025ml。

4. 微量血液振蕩器：為特制其振搖血清板的,，可使孔內(nèi)的各要素混合的更均勻,。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 紅細(xì)胞的致敏方法

   1) 紅細(xì)胞醛化：用新鮮紅細(xì)胞作間接血凝，不但紅細(xì)胞凝集的模型新鮮,、典型,，而且敏感性也好，但致敏紅細(xì)胞保存的時(shí)間短,，而且由于不同批次或不同動(dòng)物個(gè)體的細(xì)胞具有一定的差異,，可造成試驗(yàn)結(jié)果不一致，影響對(duì)結(jié)果的分析,。為了克服這一缺點(diǎn),，目前多采用醛化法(如甲醛、戊二醛或丙酮醛)固定紅細(xì)胞,，制備致敏紅細(xì)胞,。經(jīng)醛化的紅細(xì)胞在普通冰箱中?保存1年以上，而且無(wú)明顯的溶血現(xiàn)象,，致敏后的紅細(xì)胞敏感性,，一般來(lái)說(shuō)，與新鮮紅細(xì)胞沒(méi)有明顯的差別,。

取阿氏液保存的血液,，用pH值7.2 PBS洗3次，每次均為3000r/min 3min,，zui后一次去上清,，取沉積的紅細(xì)胞2.5ml，加1%戊二醛(取25%冷戊二醛10ml和pH值7.2 PBS 240ml混合制成) 250ml,，于4℃冰箱中醛化50min,，中間振搖4~5次，取出后仍呈深紅色,，極粘稠地沉積于離心管底,，須強(qiáng)力方能攪拌起來(lái)，再以pH值7.2 PBS連續(xù)洗3次,，每次均為3000r/min 3min,，zui后一次去上清，加入含0.01%硫柳汞的pH值7.2 PBS 22.5ml,，即為10%戊二醛化紅細(xì)胞液,，置4℃冰箱中保存zui少可用1年。

   2) 醛化紅細(xì)胞鞣酸化：以10%醛化紅細(xì)胞12ml,，加pH值7.2 PBS 8ml,，以3000 r/min離心3min，如此洗2次,，去上清,，再加pH值7.2 PBS 4ml，即為3%紅細(xì)胞懸液,，加4ml 1∶20 000鞣酸(1/200鞣酸用pH值7.2 PBS稀釋),，于37℃水浴中加溫15min，其間不斷振搖,，使之充分作用,，加溫完畢，以pH值7.2 PBS洗2次,，每次均3000 r/min 3min,，傾去上清，加4ml pH值7.2 PBS,，即為3%鞣酸化紅細(xì)胞液,。

   3) 鞣酸化紅細(xì)胞致敏：取鼻疽補(bǔ)反用抗原，以pH值6.4 PBS將其1∶100稀釋?zhuān)?ml稀釋的抗原加往鞣酸化紅細(xì)胞液4ml中,，于37℃水浴中作用30min,，以3000 r/min離心3min，去上清后,，再加8ml 1%兔血清緩沖鹽水,，即為間接血凝用15%致敏紅細(xì)胞診斷液(須加0.01%硫柳汞防腐)，置普通冰箱中可保存0.5～1年,。對(duì)照用紅細(xì)胞診斷液,，按上述方法以pH值6.4 PBS處理鞣酸化紅細(xì)胞即可。

操作方法

2. 實(shí)施反應(yīng)的操作方法：用微量滴管吸取1%正常兔血清pH值7.2 PBS分別滴加于血清板相鄰兩列孔中,，每孔一滴即0.025ml,，再取2支預(yù)濕的棒頭(先通過(guò)火焰燒紅、冷卻,，放蒸餾水或生理鹽水的液面上預(yù)濕1min,，注意不能將整個(gè)棒頭都浸到液體中，否則會(huì)有殘留液體,，造成不正確的結(jié)果,，再用吸水紙吸潮、校準(zhǔn))分別蘸取1∶100稀釋的被檢血清(56℃ 30min加熱滅活)0.025ml,，各插入上下二列的第1孔稀釋液中,，進(jìn)行捻轉(zhuǎn)對(duì)倍稀釋?zhuān)磙D(zhuǎn)稀釋棒的速度要適當(dāng)，太慢混合不均,，太快易造成泡沫,，使得稀釋不準(zhǔn),，通常每秒鐘捻轉(zhuǎn)2～3次為適宜，稀釋后血清第1～7孔的稀釋度分別為1∶200,、1∶400,、1∶800、1∶1600,、1∶3200,、1∶6400、1∶12800,，第8孔不加血清,，為1%兔血清PBS對(duì)照。再用微量滴管吸取鼻疽抗原致敏的紅細(xì)胞診斷液往*列的每一孔中滴加0.025ml,，再換另一支微量滴管吸取對(duì)照用鞣酸化細(xì)胞液滴加于第二列的每一孔中,，每孔也為0.025ml。然后將血凝反應(yīng)板置于微型血液振蕩器上,，振搖3～5min,，充分混勻，取下反應(yīng)板,，將其放于事先鋪有濕紗布的搪瓷盤(pán)內(nèi),，置37℃恒溫箱中1～15h(夏季放室溫下也可以)，取出觀察結(jié)果,，必要時(shí)放室溫下過(guò),，再一次觀察反應(yīng)結(jié)果，并作終判,。

3. 結(jié)果判定

判定時(shí),，應(yīng)首先看對(duì)照孔，只有在各個(gè)對(duì)照孔*正確的情況下,，說(shuō)明反應(yīng)條件正常,，方可對(duì)被檢血清列的結(jié)果作判定。

注意事項(xiàng)

1. 紅細(xì)胞也可用新鮮的,，但凝集模型不穩(wěn)定,，且不能長(zhǎng)期保存，如現(xiàn)用現(xiàn)采,，不能保證各次試驗(yàn)結(jié)果的一致性,。

2. 所用紅細(xì)胞的種類(lèi)除綿羊細(xì)胞以外，還可應(yīng)用人的O型紅細(xì)胞,，及雞,、馬的紅細(xì)胞等。

3. 被檢標(biāo)本的稀釋?xiě)?yīng)力求準(zhǔn)確，特別是使用稀釋棒進(jìn)行稀釋時(shí),，稀釋棒的旋轉(zhuǎn)次數(shù)或時(shí)間應(yīng)相對(duì)固定,，一般每個(gè)稀釋度可旋轉(zhuǎn)稀釋50～100次，稀釋棒應(yīng)盡量不碰及血清板邊緣,。

4. 血凝試驗(yàn)中,，所用致敏紅細(xì)胞濃度，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的敏感度影響很大,，一般說(shuō)，紅細(xì)胞濃度偏高,，則終點(diǎn)效價(jià)低,，紅細(xì)胞濃度低，則終點(diǎn)效價(jià)高,，故紅細(xì)胞濃度力求準(zhǔn)確穩(wěn)定,。

5. 稀釋液中的正常兔血清須經(jīng)56℃ 30min滅能，并用與致敏同批號(hào)的綿羊紅細(xì)胞充分吸收,，以去除非特異性凝集素,。

6. 稀釋棒用畢，以水沖洗干凈,，用濾紙將水吸干,，于火焰上將棒頭燒紅，冷卻后再用