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實驗原理
1. DNA段回收方法：DN片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中,，通上一定電壓進行電泳,，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開,。切下帶有所需DN片段的凝膠,，用凍融法,、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化,。
2. 利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個非模板依賴的A,，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點,，可用于PCR產(chǎn)物的克隆和測序,。
實驗試劑
1. pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)
2. TAE電泳緩沖液
3. 瓊脂糖(Agarose)
4. 6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液,，貯存于 4℃,。
5. 溴化乙錠(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器,，儲于室溫即可,。
6. 70%乙醇
7. 膠回收試劑盒(Omega公司)
實驗設備
1. 水平式電泳裝置
2. 電泳儀
3. 臺式高速離心機
4. 恒溫水浴鍋
5. 微量移液槍
6. 微波爐或電爐
7. 紫外透射儀
8. 凝膠成像系統(tǒng)或其它照相設備
實驗步驟
1. 膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物(以Omega公司 Gel Extraction Kit為例)
1) 當目的片段DNA*分離時，轉(zhuǎn)移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段,。
2) 凝膠塊轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管(離心管已經(jīng)稱重了)中,，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積(假設其密度為1g/ml),。加入等體積的Binding Buffer(XP2),，于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠*融化，每2-3 min振蕩混合物,。(在凝膠*溶解之后,，注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話,，DNA的產(chǎn)量將大大減少,。如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M,，pH為5.2的醋酸鈉,，以調(diào)低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色,。)
3) 取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(nèi)(已備好),。
4) 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉(zhuǎn)移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘,。棄收集管中的濾液,，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。
5) 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul,，一次只能轉(zhuǎn)移700ul至柱子中,，余下的可繼續(xù)重復第5步至所有的溶液都經(jīng)過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力,。如果預期產(chǎn)量較大,，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱子中。
6) 棄收集管中的濾液,，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管。轉(zhuǎn)移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中,，室溫下,， 10,000 x g下離心1min,。
7) 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管,。轉(zhuǎn)移700μl SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中,。室溫下10,000xg離心1min。(濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋,。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的,，須將其拿出置于室溫下)。
8) 重復用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子,。室溫下10,000xg離心1min,。
9) 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)收集管,。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質(zhì)殘余的液體,。
10) 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μl(具體取決于預期的終產(chǎn)物濃度)的Elution Buffer(或TE緩沖液)到柱基質(zhì)上,，室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA,。*次洗脫可以洗出70-80%的結(jié)合DNA。如果再洗脫一次的話,，可以把殘余的DNA洗脫出來,，不過那樣的濃度就會較低。
2. 連接反應(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例)
1) 在微量離心管中配制下列DNA溶液,，全量為5 μl,。
pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
dH2Oup to 5 μl
2) 加入5 μl(等量)的 Solution I。
3) 16℃反應30分鐘,。(2 kbp以上長片段PCR產(chǎn)物進行DNA克隆時,，連接反應時間請延長至數(shù)小時)。
4) 全量(10 μl)加入至100 μl 感受態(tài)細胞中,，冰中放置30分鐘,。
5) 42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘,。
6) 加入890 μl LB培養(yǎng)基,，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。
7) 在含有X-Gal,、IPTG,、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落,。計數(shù)白色,、藍色菌落。
8) 挑選白色菌落，鑒定載體中插入片段的長度大小,。
注意事項
1. 使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer,。不要重復使用，其PH的升高會減少產(chǎn)量,。
2. 不論采取何種方法回收DNA,，在回收過程中，要盡量減少洗脫體積,，以便提高收得率和濃度,，以方便后續(xù)操作。
3. 從膠上回收DNA時,，應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm),，以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒,。
4. 連接反應時間是與溫度密切相關(guān),，因為反應速度隨溫度的提高而加快。通?？刹捎?6℃連接4小時為宜,，如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率；在選擇反應的溫度與時間關(guān)系時,，也要考慮在反應系統(tǒng)中其他因素的影響,。
5. 連接反應的整個過程應注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染，為防止酶活性降低,，取酶時應在冰上操作且動作迅速,。
6. 連接反應應在25℃以下進行，溫度升高較難形成環(huán)狀DNA,，影響連接效率,。長片段PCR產(chǎn)物(2kb以上)進行連接時，連接反應時間應延長至數(shù)小時,。
7. 進行克隆時,，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比一般為1:2~10。根據(jù)實驗情況選擇合適的摩爾數(shù)比,。
8. 用的感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),，這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。
