免疫熒光是標(biāo)記免疫技術(shù)發(fā)展zui早的一種,，它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),，通過將抗體與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光步驟包括,，細(xì)胞固定和通透,，封閉，孵育一抗,，二抗等,。除了這些基本步驟，以下建議可以幫助您獲得更好的實驗結(jié)果,。 |
細(xì)胞固定和通透 |
| 為達(dá)到*的檢測效果,，細(xì)胞需要經(jīng)過固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵,，細(xì)胞和抗原需要保證*的結(jié)構(gòu),，并利于抗體與抗原結(jié)合。通常情況下,，需要通過以下步驟得以實現(xiàn)：細(xì)胞用2%-4%多聚甲醛固定,，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進行通透,。前者是比較溫柔的處理，但是對于核內(nèi)抗原可能無效,，需要用到Triton,。使用皂角苷進行通透時，要注意它會引起細(xì)胞膜的可逆性通透,，也就是除了在通透初期,，在每個抗體孵育環(huán)節(jié)都需要進行通透。另外,，細(xì)胞可以用冰甲醇進行同時固定和通透,，可以避免去垢劑的使用。 | 抗體特異性 |
| 免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體,，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結(jié)果,。在大多數(shù)情況下，純化抗體的效果很好,，但是正確的對照可以幫助定位抗原,。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾,。 | 合適的抗體稀釋比例 |
| 通過優(yōu)化抗體稀釋比例來優(yōu)化染色,，通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達(dá)到特異性染色的結(jié)果。但在能保證低背景染色的前提下,，可以通過增加濃度來提高信號強度,。如果是*次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗,。 | 優(yōu)化緩沖液和封閉劑 |
| 盡管很多抗原在常見的Buffer如PBS中可以很好的被染色,，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液,，比如鈣,、鎂、鉀等,，可以帶來很大程度上的改善。Rockland可提供優(yōu)化過的IHC用封閉緩沖液,，同樣適用于熒光染色實驗,。 | 選擇正確的二抗 |
| 如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預(yù)吸附的二抗進行單染實驗,；如果是雙重甚至是多重染色,，那么必須使用預(yù)吸附的二抗。同時,，請優(yōu)先選擇來自同一物種的二抗,。 | 使用合適的細(xì)胞密度 |
| 選擇合適的細(xì)胞數(shù)量進行染色，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量過多時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不好,，導(dǎo)致染色背景深,，低細(xì)胞密度，會使細(xì)胞貼壁不佳,，狀態(tài)不好,。 | 多重染色 |
| 對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色,，但要求兩個一抗的種屬來源不同,，標(biāo)記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致,。 | 降低背景 |
| 高背景是免疫熒光常見的問題,，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替BSA做封閉液，降低抗體濃度,，增加洗滌次數(shù),，洗滌至少三次，每次五分鐘,，推薦洗滌液為PBS+0.05%Tween,。 | 封片 |
| 作為免疫熒光的zui后一步，可以提高折射率,，保護樣品,。 | 數(shù)據(jù)分析 |
| 觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細(xì)胞進行數(shù)據(jù)獲取與分析,。 詳情見：http://www.rockland-inc,。。ｃｏｍ/IF-Microscopy-Tips.aspx?utm_source=tips&utm_medium=&utm_campaign=marker |
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