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微生物菌種冷凍干燥和液氮保藏菌種技術(shù)
－,、安瓶管開封
1．用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管,。
2．用火焰將安瓿管頂端加熱,。
3．滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。
4．用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端,。
二,、菌株恢復(fù)培養(yǎng)
1．用無菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基,，滴人安瓿管內(nèi),，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀,。
2．取0.1～0.2ml菌體懸浮液,，移植于適宜的瓊脂斜面／平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液,，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi),，然后在建議的溫度下培養(yǎng),。
3．若未能活化,，或活化后有疑問時,，請于收到菌種1個月內(nèi)，通知保藏中心,，經(jīng)查證無誤后,，即免費(fèi)補(bǔ)寄。
三,、注意事項(xiàng)
1．菌種活化前,，請將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。
2．厭氧菌的培養(yǎng),，如無特別說明,，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填,，以保持厭氧狀態(tài),。
3．某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長,，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長,，此時請將步驟二(2)重復(fù)一次。
液氮超低溫保藏程序
1,、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶,。
2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘,，沖洗干凈,，棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。
3,、打印標(biāo)簽（激光打?。?nbsp;
4,、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶,，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中,，略擰緊螺旋蓋,，再行121℃滅菌30分鐘。
5,、保藏菌菌齡：處于zui大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期,。
6、保護(hù)劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,。
1）甘油的準(zhǔn)備：在121℃滅菌15分鐘，2-8℃貯存,。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存,，然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液,，則以zui終所需濃度的水溶液保存,。
2）二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗,。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存,。
7、分裝：在無菌條件下,，將細(xì)胞懸液（從平板上打下直徑為5cm的菌塊）分裝于安培瓶中,，并注入保護(hù)劑，擰緊螺旋蓋,。
8,、將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標(biāo)簽,。為了便于取用,，一般一個鋁夾上僅放一個菌株。
9,、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃,，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃,，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃,。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存。
10,、菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出,，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后,，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),。
